2.2. Reagents and enzymesRestrictio

2.2. Reagents and enzymes
Restriction endonucleases and T4-DNA ligase were
purchased from Stratagene. Genescreen Plus Nylon
membranes were procured from NEN Research Products
(Dupont, Wilmington, USA). All reagents and chemicals
used were of molecular biology grade (Sigma,
St. Louis, USA)
2.3. Construction of plant transformation vector
Plasmid pGEM-4Z carrying a synthetic cry1Ac gene
(Sardana et al., 1996) was digested by BamHI and the 2.10
kb fragment with the gene and nos-terminator was inserted
into the BamHI site of the binary vector plasmid
pBinAR (Hofgen and Willmitzer, 1990) which contains
a CaMV 35S promoter and octopine synthase poly (A)
sequence. The resulting vector was designated as
pBinBt3. The sense orientation of cry1Ac gene was con-
"rmed by restriction analysis of pBinBt3 DNA using the
enzyme EcoRI (Fig. 1).
2.4. Plant transformation
Tomato (Lycopersicon esculentum cv. Pusa Ruby) seedlings
were raised aseptically on half-strength Murashige
and Skoog (MS) medium in Magenta boxes. Cotyledonary
leaves from 10-day old seedlings were excised and
used for infection and cocultivation with A. tumefaciens
(McCormick, 1991).
A. tumefaciens was grown in yeast extract}mannitol
(YEM) medium for 48 h at 283C and diluted 20-fold
before use. Explants were cocultivated with diluted A.
tumefaciens for 48 h at 263C (16L/8D). The explants
were incubated in Petri dishes on regeneration/selection
medium containing MS salts, B5 vitamins, 3% sucrose,
1.0 mg/l zeatin, 100 mg/l kanamycin, 500 mg/l Cefotaxime
and 0.2% Phytagel (pH 5.8). The culture conditions
were 263C, 16 h photoperiod and light intensity of
150 lEm~2 s~1. The explants were sub-cultured every
two weeks. The regenerated shoots were grown in
Magenta boxes on root induction medium containing
MS salts, 3% sucrose, 50 mg/l kanamycin, 300 mg/l
Cefotaxime and 0.2% Phytagel. The rooted plants were
transplanted into small pots containing vermiculite. After
establishment, the plants were shifted to large earthen
pots in the greenhouse.
2.5. Polymerase chain reaction (PCR) analysis
Genomic DNA was isolated from the leaves of 43
putative transformant shoots as described by Saghai-
Maroof et al. (1984). PCR analysis was carried out by
using the primers speci"c to nptII gene.
Forward primer: 5 @ - C A A T C G G C TG C T C -
TGATGCCG- 3@.
Reverse primer: 5 @ - A G G C G A T A G A A G -
GCGATGCGC- 3@.
PCR was carried out for 30 cycles (943C, 1 min; 553C,
1 min and 723C, 2 min). The reaction was carried out at
943C for 2 min and 723C for 5 min, during the "rst and
last cycles, respectively.
2.6. Southern analysis
Isolation of total genomic DNA from the leaves of six
plants which exhibited high levels of insect protection in
preliminary bioassays, was performed by the procedure
described by Saghai}Maroof et al. (1984). DNA samples
were digested with HindIII, electrophoresed on 0.8%
agarose gel and transferred onto Genescreen Plus membrane.
Southern hybridization was carried out with a
32P-dCTP-labelled BamHI insert (2.1 kb) separated from
pGEM-cry1Ac according to Sambrook et al. (1989).
2.7. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Rapidly growing leaves (500 mg) were frozen and
ground in liquid nitrogen. The leaf powder was extracted
with phosphate-bu!ered saline/Tween (PBST) (Sambrook
et al., 1989). The leaf extracts were centrifuged and
the supernatants were immediately used for protein estimation
(Bradford, 1976). The extracts were tested by
a double-antibody sandwich quantitative ELISA as described
previously (Kumar et al., 1998). Antibodies raised
in rabbits against pure Cry1Ac protein (Prof. Donald
Dean,Ohio State University, Columbus, OH) were used.
2.8. Insect bioassays
Helicoverpa armigera was reared in the laboratory on
semi-synthetic diet (Padidam, 1992). Five larvae (second
instar) each were released on the leaf circles (2.5 cm
diameter) and fruits of normal and seven transgenic
tomato plants (T0). Rapidly growing leaves of one month
old tomato plants were selected for the bioassays. The
leaf disks were placed on moist Whatman (d1) "lter
paper disks in multiwell tissue culture plates (Greiner).
Fruits were sampled at full maturity and placed in Magenta
boxes on moist "lter paper. Larval mortality was
recorded after seven days. Three replications were taken
for each bioassay. The experiment was repeated twice.
2.9. Progeny test
The seeds of the T0 generation plants (selfed) were
germinated in small pots. The T1 generation plants (30
plants per line) were analysed by PCR using synthetic
cry1Ac-speci"c primers. Genomic DNA was isolated
from the leaves (Saghai-Maroof et al., 1984) and PCR
was performed as described in Section 2.5.
Forward primer: 5 @ - CCCAGAAGTTGAAG -
TACTTGGTGG-3@.
Reverse primer: 5 @ - C C G A T A T T G A A G -
GGTCTTCTGTAC-3@.
2.10. Limited xeld trial
The seeds of the T0 generation plants (selfed) were
sown in earthen pots and the seedlings were transplanted
into a plot (sandy loam soil of Indian Agricultural Research
Institute farm) measuring 38]31 metres. Progeny
of four transgenic lines (Bt2, Bt4, Bt6 and Bt7) were
selected for the trial along with normal tomato (cv. Pusa
Ruby). Three rows of each line (one normal and four
transgenics) were planted. The inter-row and inter-plant
distance was 90 cm. The test plants were surrounded by
two border rows (5 m apart) of normal tomato plants.
Normal cultural practices for tomato cultivation were
followed during the course of the experiment. No insecticides
were sprayed on the plot. Arti"cial infestation of the
plot was done with the eggs of H. armigera. Pieces of
muslin cloth on which H. armigera eggs were laid, were
tied to the plants at the time of #owering. The procedure
was followed every two weeks. Data pertaining to the
number of fruits damaged were collected until the end of
the crop growing season. PCR was performed using
cry1Ac primers to identify the segregants that do not
carry the foreign gene and the fruit damage data of such
plants were not considered during the "nal analysis.

Results (Thai) 1:

2.2. reagents และเอนไซม์Endonucleases จำกัดและ T4 DNA ligaseซื้อจาก Stratagene พลัส Genescreen ไนล่อนเยื่อหุ้มถูกค้นหาจากฆราวาสวิจัยผลิตภัณฑ์(ดูปองท์ วิลมิ สหรัฐอเมริกา) Reagents และเคมีทั้งหมดใช้อยู่ที่ระดับอณูชีววิทยา (ซิกSt. Louis สหรัฐอเมริกา)2.3 การสร้างเวกเตอร์การแปลงพืชPGEM plasmid-แบกยีนสังเคราะห์ cry1Ac 4Z(Sardana et al., 1996) ถูกต้องตาม BamHI และ 2.10 การส่วน kb มียีนและหมายเลขเทอร์มิเนเตอร์ถูกแทรกในเว็บไซต์ BamHI ของ plasmid vector ไบนารีpBinAR (Hofgen และ Willmitzer, 1990) ซึ่งประกอบด้วยเป็น CaMV 35S โปรโมเตอร์และ octopine synthase โพลี (A)ลำดับนั้น เวกเตอร์ผลถูกกำหนดให้เป็นpBinBt3 แนวความรู้สึกของยีน cry1Ac ได้คอน-" rmed โดยวิเคราะห์ข้อจำกัดของการใช้ดีเอ็นเอ pBinBt3เอนไซม์ EcoRI (Fig. 1)2.4 แปลงพืชมะเขือเทศ (Lycopersicon esculentum พันธุ์ทับทิม Pusa) กล้าไม้มีเลี้ยง aseptically Murashige แรงครึ่งและกลาง Skoog (MS) ในกล่องสีชมพูแกมม่วง Cotyledonaryออกจากกล้าไม้ที่ 10 - วันเก่าถูก excised และใช้สำหรับการติดเชื้อและ cocultivation กับ A. tumefaciens(แมคคอร์มิค 1991)A. tumefaciens ถูกปลูกในสารสกัดยีสต์} mannitolปานกลาง (YEM) 48 h ที่ 283C และแตกออก 20-foldก่อนใช้งาน Explants ได้ cocultivated ด้วยยกเว้นอ.tumefaciens สำหรับ h 48 ที่ 263C (16L / 8D) ใน explantsมี incubated ในจาน Petri ในฟื้นฟู/การเลือกสื่อที่ประกอบด้วย MS เกลือ วิตามิน B5 ซูโครส 3%1.0 mg/l ซีเอติน กานามัยซิน 100 mg/l, l 500 มิลลิกรัมเซฟโฟแทกซิมและ 0.2% Phytagel (pH 5.8) สภาพวัฒนธรรม263C, 16 h ชั่วโมง และความเข้มของแสง150 lEm ~ 2 s ~ 1 Explants ถูกย่อยอ่างทุกสัปดาห์ที่สอง ถ่ายภาพ regenerated ได้เติบโตขึ้นในกล่องม่วงบนรากเหนี่ยวนำขนาดกลางประกอบด้วยMS salts ซูโครส 3% กานามัยซิน 50 mg/l, 300 mg/lเซฟโฟแทกซิมและ 0.2% Phytagel พืช rooted ได้transplanted ลงในกระถางขนาดเล็กที่ประกอบด้วย vermiculite หลังจากก่อตั้ง พืชผลจากขนาดใหญ่เป็นกระถางในเรือนกระจก2.5 การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) พอลิเมอเรสGenomic DNA ถูกแยกต่างหากจากใบของ 43putative transformant หน่อตามที่อธิบายไว้ โดย Saghai-Maroof et al. (1984) วิเคราะห์ PCR ถูกดำเนินการโดยใช้ speci ไพรเมอร์ "c ถึงยีน nptIIรองพื้นไปข้างหน้า: 5 แอ - C A A T C G G C TG C T C -TGATGCCG-3 แอกลับวัสดุรองพื้น: 5 แอ - A G G C G A T A G A A G -GCGATGCGC-3 แอPCR ได้รับการดำเนินการ 30 รอบ (943C, 1 นาที 553 C1 นาทีแล้ว 723 C, 2 นาที) ปฏิกิริยาเกิดขึ้นใน943 C 2 นาทีและ 723C สำหรับ 5 นาที ในระหว่าง "บริษัทอาร์เอสที และล่าสุด รอบ ตามลำดับ2.6. ภาคใต้วิเคราะห์แยกดีเอ็น genomic รวมจากใบไม้ 6พืชซึ่งจัดแสดงแมลงป้องกันในระดับสูงbioassays เบื้องต้น ทำตามขั้นตอนอธิบาย โดย Saghai } Maroof et al. (1984) ตัวอย่างดีเอ็นเอถูกต้องกับ HindIII, electrophoresed ใน 0.8%agarose เจ และโอนย้ายไปบวก Genescreen เมมเบรนHybridization ภาคใต้ได้ดำเนินการด้วยการBamHI P 32-dCTP-มันแทรก (2.1 kb) แยกออกจากpGEM-cry1Ac ตาม Sambrook et al. (1989)2.7. เอนไซม์ลิงค์ immunosorbent assay (ELISA)เติบโตเร็วใบ (500 มิลลิกรัม) ถูกแช่แข็ง และพื้นในไนโตรเจนเหลว ผงถูกสกัดมีฟอสเฟต bu ! ered น้ำ เกลือ/Tween (PBST) (Sambrookร้อยเอ็ด al., 1989) สารสกัดจากใบถูก centrifuged และsupernatants ถูกใช้สำหรับโปรตีนประมาณทันที(แบรดฟอร์ด 1976) สารสกัดจากการทดสอบโดยสองแอนติบอดีแซนด์วิช ELISA เชิงปริมาณตามก่อนหน้านี้ (Kumar et al., 1998) แอนตี้ยกในกระต่ายกับโปรตีน Cry1Ac บริสุทธิ์ (ศาสตราจารย์โดนัลด์คณบดี มหาวิทยาลัยรัฐโอไฮโอ โคลัมบัส OH) ถูกใช้2.8. แมลง bioassaysHelicoverpa armigera เป็นผลิตภัณฑ์ในห้องปฏิบัติการในกึ่งสังเคราะห์อาหาร (Padidam, 1992) ตัวอ่อนห้า (สองinstar) แต่ละนำออกใช้บนวงกลมใบไม้ (2.5 ซม.เส้นผ่าศูนย์กลาง) และผลไม้ปกติและเจ็ดถั่วเหลืองมะเขือเทศพืช (T0) ใบหนึ่งเดือนการเจริญเติบโตอย่างรวดเร็วพืชมะเขือเทศเก่าถูกเลือกสำหรับการ bioassays ที่ใบดิสก์ถูกวางบน Whatman (ง 1) "และวัสดุเป็นชุ่มชื่นดิสก์กระดาษในแผ่นเยื่อ multiwell (Greiner)ผลไม้ตัวอย่างเต็มที่ และวางในม่วงกล่องบนชุ่มชื่น "และวัสดุเป็นกระดาษ มีการตาย larvalบันทึกหลังจากเจ็ดวัน ระยะที่สามที่ถ่ายสำหรับแต่ละ bioassay ทดลองถูกทำซ้ำสอง2.9. ลูกหลานที่ทดสอบมีเมล็ดพันธุ์ของพืชรุ่น T0 (selfed)เปลือกงอกในหม้อขนาดเล็ก พืชรุ่น T1 (30พืชต่อบรรทัด) ถูก analysed โดยใช้สังเคราะห์ PCRcry1Ac speci "ไพรเมอร์ค Genomic DNA ถูกแยกจากใบไม้ (Saghai Maroof et al., 1984) และ PCRที่ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในส่วน 2.5ส่งต่อรองพื้น: แอท - CCCAGAAGTTGAAG - 5TACTTGGTGG-3 แอกลับวัสดุรองพื้น: 5 แอท -ซี C G A T A T T G A A G -GGTCTTCTGTAC-3 แอ2.10 การทดลอง xeld จำกัดมีเมล็ดพันธุ์ของพืชรุ่น T0 (selfed)หว่านในหม้อ และกล้าไม้ถูก transplantedเป็นแผน (ดินทราย loam วิจัยเกษตรของอินเดียInstitute farm) วัด 38] 31 เมตร ลูกหลานสี่เส้นถั่วเหลือง (Bt2, Bt4, 6 บาท และ Bt7) ได้สำหรับทดลองกับมะเขือเทศปกติ (พันธุ์ Pusaทับทิม) แถวสามของแต่ละบรรทัด (ปกติหนึ่งและสี่มีปลูก transgenics) ระหว่างแถวและระหว่างต้นระยะทาง 90 ซม.ได้ พืชทดสอบถูกล้อมรอบด้วยสองชายแดนแถว (5 เมตรห่างกัน) ของพืชมะเขือเทศปกติปฏิบัติวัฒนธรรมปกติสำหรับการเพาะปลูกมะเขือเทศได้ตามในระหว่างการทดลอง ไม่มียาฆ่าแมลงถูกฉีดพ่นในแปลง อา "รบกวนซึ่งกันและกันของการแปลงที่ทำกับไข่ของ H. armigera ชิ้นส่วนของผ้ามัสลินใน H. ที่ armigera ไข่ถูกวาง ถูกเกี่ยวพันกับพืชเวลา #owering ขั้นตอนการถูกตามทุกสองสัปดาห์ ข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับการจำนวนผลไม้ที่เสียหายถูกรวบรวมจนถึงสิ้นฤดูเจริญเติบโตพืช ทำ PCR โดยใช้ไพรเมอร์ cry1Ac ระบุ segregants ที่ไม่มียีนต่างประเทศและข้อมูลความเสียหายของผลไม้ผลพืชไม่ได้ถือในระหว่าง "nal วิเคราะห์

Results (Thai) 2:

2.2 รีเอเจนต์และเอนไซม์ข้อ จำกัด endonucleases และลิกาเซ T4 ดีเอ็นเอถูกซื้อมาจากStratagene Genescreen ไนล่อนพลัสเยื่อถูกจัดหาจากNEN ผลิตภัณฑ์การวิจัย(ดูปองต์วิลมิง, สหรัฐอเมริกา) สารเคมีและสารเคมีที่ใช้เป็นของเกรดอณูชีววิทยา (Sigma, เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา) 2.3 การก่อสร้างของการเปลี่ยนแปลงพืชเวกเตอร์พลาสมิด pGEM-4Z แบกยีนสังเคราะห์ cry1Ac (Sardana et al., 1996) ถูกย่อยโดย BamHI และ 2.10 ส่วนกิโลกับยีนและการกัดกร่อน-เทอร์มิถูกแทรกเข้าไปในเว็บไซต์ BamHI ของเวกเตอร์ไบนารีพลาสมิด pBinAR (Hofgen และ Willmitzer, 1990) ซึ่งมีผู้ก่อการCaMV 35S และ octopine โพลีเทส (A) ตามลำดับ เวกเตอร์ส่งผลให้ถูกกำหนดให้เป็นpBinBt3 ทิศทางความรู้สึกของความเป็นยีน cry1Ac ทำา"rmed โดยการวิเคราะห์ข้อ จำกัด ของการ pBinBt3 ดีเอ็นเอโดยใช้เอนไซม์EcoRI (รูปที่ 1).. 2.4. การเปลี่ยนแปลงพืชมะเขือเทศ(Lycopersicon esculentum พันธุ์. Pusa ทับทิม) ต้นกล้าถูกยกปลอดเชื้อในอาหารสูตรMurashige ครึ่งความแข็งแรงและSkoog (MS) ขนาดกลางในกล่อง Magenta. cotyledonary ใบจากต้นกล้าวัย 10 วันถูกตัดและใช้สำหรับการติดเชื้อและcocultivation กับ A. tumefaciens (แมค 1991). tumefaciens เอได้รับการปลูกในสารสกัดจากยีสต์} แมนนิทอล(YEM) สื่อกลางในการ 48 ชั่วโมงที่ 283C และเจือจาง 20 เท่าก่อนการใช้งาน. ชิ้นถูกปรับลด cocultivated กับ A. tumefaciens 48 ชั่วโมงที่ 263C (16L / 8). โดยชิ้นถูกบ่มในจานเลี้ยงเชื้อในการฟื้นฟู/ เลือกสื่อที่มีเกลือMS, วิตามินบี 5 น้ำตาลซูโครส 3%, 1.0 mg / l zeatin 100 mg / l กานามัยซิน 500 มิลลิกรัม / ลิตร cefotaxime และ 0.2% phytagel (pH 5.8). เงื่อนไขวัฒนธรรมเป็น263C, 16 ชั่วโมงช่วงแสงและความเข้มของแสง150 LEM ~ 2 s ~ 1 . โดยเป็นชิ้นย่อยเลี้ยงทุกสองสัปดาห์. หน่อปลูกสร้างใหม่ในกล่องสีม่วงแดงบนสื่อเหนี่ยวนำรากที่มีเกลือ MS ซูโครส 3% 50 mg / l กานามัยซิน 300 มิลลิกรัม / ลิตร cefotaxime และ 0.2% phytagel พืชที่หยั่งรากถูกปลูกลงในกระถางขนาดเล็กที่มีดิน หลังจากที่สถานประกอบการโรงงานที่ถูกย้ายไปดินขนาดใหญ่กระถางในเรือนกระจก. 2.5 ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (PCR) การวิเคราะห์จีโนมดีเอ็นเอที่แยกได้จากใบ43 หน่อ transformant สมมุติตามที่อธิบาย Saghai- Maroof et al, (1984) การวิเคราะห์ PCR ได้ดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ที่ระบุ"c เพื่อยีน nptII. ไพรเมอร์ไปข้างหน้า: 5 @ - CAATCGGC TG CTC - TGATGCCG- 3 @. ย้อนกลับไพรเมอร์: 5 @ - AGGCGATAGAAG -. GCGATGCGC- 3 @ PCR ได้ดำเนินการ 30 รอบ (943C, 1 นาที; 553C, 1 นาทีและ 723C, 2 นาที). ปฏิกิริยาได้ดำเนินการที่943C เป็นเวลา 2 นาทีและ 723C เป็นเวลา 5 นาทีในช่วง "แรกและรอบที่ผ่านมาตามลำดับ. 2.6 การวิเคราะห์ทางตอนใต้ของการแยกดีเอ็นเอจากใบรวมหกพืชซึ่งแสดงระดับสูงของการป้องกันแมลงในbioassays เบื้องต้นได้ดำเนินการโดยขั้นตอนการอธิบายโดยซาไก} Maroof et al, (1984) ตัวอย่างดีเอ็นเอถูกย่อยด้วย HindIII, electrophoresed บน 0.8% เจล agarose และโอนไปยังเมมเบรน Genescreen พลัส. ผสมพันธุ์ภาคใต้ได้ดำเนินการออกมาพร้อมกับใส่ BamHI 32P-dCTP ติดฉลาก (2.1 กิโล) แยกออกจาก pGEM-cry1Ac ตาม Sambrook et al, (1989). 2.7 เอนไซม์ที่เชื่อมโยงการทดสอบอิมมูโน (ELISA) เติบโตอย่างรวดเร็วใบ (500 มก.) เป็นแช่แข็งและพื้นดินในไนโตรเจนเหลว ผงใบถูกสกัดด้วยฟอสเฟต bu! ered น้ำเกลือ / Tween (PBST) (Sambrook et al., 1989) สารสกัดจากใบหมุนเหวี่ยงและsupernatants ถูกนำมาใช้ทันทีสำหรับการประมาณโปรตีน(แบรด, 1976) สารสกัดถูกทดสอบโดยแซนวิชดับเบิลแอนติบอดี ELISA เชิงปริมาณตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(Kumar et al., 1998) แอนติบอดียกกระต่ายกับโปรตีน Cry1Ac บริสุทธิ์ (ศ. โดนัลด์คณบดีOhio State University, โคลัมบัส, โอไฮโอ) ถูกนำมาใช้. 2.8 แมลง bioassays Helicoverpa armigera ถูกเลี้ยงในห้องปฏิบัติการบนอาหารกึ่งสังเคราะห์(Padidam, 1992) ห้าตัวอ่อน (ที่สองวัย) โดยได้รับการปล่อยตัวในวงการใบ (2.5 ซม. เส้นผ่าศูนย์กลาง) และผลไม้ปกติเจ็ดพันธุ์มะเขือเทศ(T0) เติบโตอย่างรวดเร็วใบหนึ่งเดือนมะเขือเทศเก่าถูกเลือกสำหรับ bioassays ดิสก์ใบถูกวางไว้บนชื้นเบอร์ (d1) "กรองดิสก์แผ่นกระดาษในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อmultiwell (เกรนเนอร์). ผลไม้ที่ได้รับตัวอย่างที่ครบกําหนดเต็มรูปแบบและวางไว้ใน Magenta กล่องบนชื้น" กระดาษกรอง การตายของตัวอ่อนได้รับการบันทึกไว้หลังจากเจ็ดวัน ซ้ำสามถูกนำสำหรับแต่ละชีวภาพ การทดลองซ้ำกันสองครั้ง. 2.9 ลูกหลานทดสอบเมล็ดของพืชรุ่น T0 (selfed) ได้รับการงอกในกระถางขนาดเล็ก พืชรุ่น T1 (30 พืชต่อบรรทัด) ถูกนำมาวิเคราะห์โดยวิธี PCR โดยใช้สังเคราะห์cry1Ac-speci "ไพรเมอร์ค. ดีเอ็นเอจีโนมที่แยกได้จากใบ(ซาไก-Maroof et al., 1984) และ PCR ได้ดำเนินการตามที่ระบุไว้ในมาตรา 2.5 ไพรเมอร์ไปข้างหน้า: 5 @ - CCCAGAAGTTGAAG -. TACTTGGTGG-3 @ ย้อนกลับไพรเมอร์: 5 @ - CCGATATTGAAG -. GGTCTTCTGTAC-3 @. 2.10 ทดลอง จำกัด xeld เมล็ดของพืชรุ่น T0 (selfed) ถูกหว่านลงในกระถางดินและต้นกล้าได้ปลูกลงในพล็อต(ดินดินร่วนปนทรายวิจัยอินเดียการเกษตรฟาร์มInstitute) วัด 38] 31 เมตร. ลูกหลานของสี่สายพันธุ์(2 บาท 4 บาท, 6 และ 7 บาท) ได้รับเลือกสำหรับการพิจารณาคดีพร้อมกับมะเขือเทศปกติ(พันธุ์. Pusa ทับทิม) . สามแถวของแต่ละบรรทัด (อย่างใดอย่างหนึ่งตามปกติและสี่transgenics) ถูกนำมาปลูก. โดยระหว่างแถวและระหว่างพืชระยะ90 ซม. การทดสอบพืชถูกล้อมรอบไปด้วยสองแถวชายแดน(5 เมตรออกจากกัน) ของมะเขือเทศปกติ. ปกติทางวัฒนธรรม การปฏิบัติสำหรับการเพาะปลูกมะเขือเทศที่ถูกใช้ในช่วงของการทดสอบ. ยาฆ่าแมลงที่ไม่ถูกพ่นบนพล็อต Arti "รบกวนทางการของพล็อตที่ได้กระทำกับไข่ของเอชarmigera ได้. ชิ้นส่วนของผ้ามัสลินที่เอชarmigera ไข่ถูกวางถูกผูกติดอยู่กับพืชในขณะที่#owering ได้. ขั้นตอนตามมาทุกสองสัปดาห์ข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับจำนวนของผลไม้ได้รับความเสียหายถูกเก็บจนกว่าจะสิ้นสุดของการปลูกพืชฤดูการเจริญเติบโต. PCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์cry1Ac การระบุลูกผสมที่ไม่ได้ดำเนินการถ่ายทอดทางพันธุกรรมต่างประเทศและข้อมูลความเสียหายของผลไม้ดังกล่าวพืชไม่ได้พิจารณาในช่วง" การวิเคราะห์ NAL

Results (Thai) 3:

2.2 . สารเคมีและเอนไซม์ไลเกส และ t4-dna สงบเงียบ
จำกัดจำนวน
ซื้อจาก stratagene . genescreen บวกเยื่อไนลอน
ถูกจัดหาจากผลิตภัณฑ์งานวิจัย เณร
( ดูปองท์ วิลมิงตัน , สหรัฐอเมริกา ) สารเคมีและสารเคมี
ใช้ของเกรดอณูชีววิทยา ( Sigma ,
เซนต์หลุยส์ สหรัฐอเมริกา )
2.3 การก่อสร้างโรงงานแปลงเวกเตอร์พลาสมิดพาหะสังเคราะห์ pgem-4z

cry1ac ยีน( sardana et al . , 1996 ) ถูกย่อยด้วย BamHI และ 2.10
กิโลเบสกับยีนเทอร์มิเนเตอร์ NOS แทรก
ลงในเว็บไซต์ของไบนารี BamHI เวคเตอร์
pbinar ( hofgen และ willmitzer 1990 ) ซึ่งมีการ octopine synthase และ 35S CaMV promoter poly ( A )
ลำดับ ผลเวกเตอร์คือเขตเป็น
pbinbt3 . ความรู้สึกการปฐมนิเทศของยีน cry1ac con -
คือ" rmed โดยการวิเคราะห์ข้อจํากัดของดีเอ็นเอ pbinbt3 โดยใช้เอนไซม์ EcoRI
( รูปที่ 1 ) .
2.4 . การปลูกมะเขือเทศ ( มะเขือเทศ
lycopersicon พันธุ์ ปุซาทับทิม ) ต้นกล้า
ถูกยก aseptically ครึ่งแรง อาหารสูตร Murashige และ Skoog ( MS )
) ในกล่องสีบานเย็น . cotyledonary
ใบจากต้นกล้าอายุ 10 วันถูกตัดและใช้สำหรับการติดเชื้อและการเพาะเลี้ยงเซลล์ร่วมด้วย

( A . tumefaciens McCormick , 1991 )
.ซี ปลูกในสารสกัดจากยีสต์ } 5
( แย้ม ) ( 48 ชั่วโมงและ 20 เท่า
283c ที่เจือจางก่อนใช้ เนื้อเยื่อที่ถูก cocultivated กับเจือจาง A .
ซี 48 ชั่วโมงใน 263c ( 16L / 8D ) เนื้อเยื่อที่ถูกเลี้ยงในจานเลี้ยงเชื้อบน

ใหม่ / การเลือกอาหารที่มีนางสาวเกลือ , B5 วิตามิน ซูโครส 3 เปอร์เซ็นต์
1.0 มก. / ล. ซีเอติน 100 มก. / ล. น 500 มก. / ล. และโฟ
0.2% phytagel ( pH 58 ) วัฒนธรรมเงื่อนไข
ถูก 263c แสง ช่วงแสง 16 ชั่วโมงและความเข้มแสงของ
150 เล็ม ~ 2 S ~ 1 การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่ถูกย่อยทุก
2 สัปดาห์ สร้างใหม่ยอดเติบโตใน
กล่องสีบานเย็นราก induction medium ที่ประกอบด้วย
นางสาวเกลือซูโครส 3 เปอร์เซ็นต์ 50 มก. / ล. และ kanamycin , 300 mg / l
ใส่ไคล้และ 0.2 เปอร์เซ็นต์ phytagel . รากพืชปลูกในกระถางเล็ก ๆผสมเวอร์มิคูไลท์
. หลังจาก
ก่อตั้ง พืชที่ถูกย้ายไปที่กระถางกระถางในเรือนกระจกขนาดใหญ่
.
2.5 ปฏิกิริยาลูกโซ่ ( PCR ) การวิเคราะห์
genomic DNA ที่ถูกแยกจากใบของ 43 /
ซึ่งยิงตามที่อธิบายไว้โดย saghai -
maroof et al . ( 1984 ) กระทำโดยการวิเคราะห์ PCR โดยใช้ primers speci
" C nptii ยีน
ส่งต่อรองพื้น : 5 @ - C A T C G C G C สายการบินไทย T C -
tgatgccg - 3 @ .
reverse primer :5 @ - G G C G A T A G A G -
gcgatgcgc - 3 @ .
PCR พบว่า 30 รอบ ( 943c 1 นาที ; 553c 723c
1 นาที , 2 นาที ) ปฏิกิริยาที่ถูกดำเนินการที่
943c 2 นาทีและ 723c นาน 5 นาทีในช่วง " ใจและ

รอบสุดท้ายตามลำดับ 2.6 การวิเคราะห์
แยกภาคใต้ของดีเอ็นเอทั้งหมดจากใบหก
พืชซึ่งแสดงระดับสูงของการป้องกันแมลงใน
ละเอียดเบื้องต้น ,โดยใช้ขั้นตอนที่อธิบายโดย saghai }
maroof et al . ( 1984 ) ตัวอย่างดีเอ็นเอที่ถูกตัดด้วย
- electrophoresed บน , เจล , 0.8% และโอนไปยัง genescreen บวก

วิธี Southern hybridization โดยใช้เยื่อแผ่น ด้วย
32p dctp labelled BamHI แทรก ( 1 KB ) แยกจาก
pgem-cry1ac ตาม sambrook et al . ( 1989 ) .
2.7 . เอนไซม์ลิงค์ immunosorbent assay ( ELISA )
เติบโตอย่างรวดเร็ว ใบ ( 500 มิลลิกรัม ) ถูกแช่แข็งและ
บดในไนโตรเจนเหลว ใบผงสกัด
กับบูฟอสเฟต ! เรด น้ำเกลือ / Tween ( pbst ) ( sambrook
et al . , 1989 ) สารสกัดจากใบและมีไฟฟ้าใช้ supernatants ได้ทันที

ประมาณโปรตีน ( แบรดฟอร์ด , 1976 ) สารสกัดจากข้อมูลเชิงปริมาณแอนติบอดีแซนวิชคู่ด้วย

) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( Kumar et al . , 1998 ) แอนติบอดีต่อโปรตีนในกระต่ายเลี้ยง
cry1ac บริสุทธิ์ ( ศ. โดนัลด์
คณบดี , มหาวิทยาลัย , รัฐโอไฮโอโคลัมบัส , โอไฮโอ ) ใช้
2.8 . แมลงละเอียด
Helicoverpa armigera เลี้ยงในห้องปฏิบัติการบน
อาหารกึ่งสังเคราะห์ ( padidam , 1992 ) ( 5 ) ระยะที่สอง
) แต่ละถูกปล่อยออกมาบนใบวงกลม ( 2.5 ซม.
เส้นผ่าศูนย์กลาง ) และผลไม้ของต้น
ปกติและเจ็ดพืชมะเขือเทศ ( t0 ) การเติบโตอย่างรวดเร็วของใบหนึ่งเดือน
เก่ามะเขือเทศถูกเลือกให้ละเอียด .
ใบดิสก์ไว้ให้ชุ่มชื้น whatman ( D1 ) " lter
กระดาษแผ่นในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ multiwell แผ่น ( ไกรเนอร์ ) .
ผลไม้เต็มจำนวนเมื่อครบกำหนด และวางไว้ในกล่องสีบานเย็น
บนกระดาษ lter ชุ่มชื้น " หนอนตาย
บันทึกหลังจากเจ็ดวัน สามซ้ำถ่าย
แต่ละไม่ และทำการทดลองซ้ำ สองครั้ง
2.9 . รุ่นทดสอบ
เมล็ดของพืชรุ่น t0
( selfed ) งอกในกระถางขนาดเล็ก T1 รุ่นพืช ( 30
พืชต่อบรรทัด ) วิเคราะห์โดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์สังเคราะห์
cry1ac ประเภท " C . ดีเอ็นเอที่แยกได้จากใบ ( saghai
maroof et al . , 1984 ) และ PCR
มีการปฏิบัติที่อธิบายไว้ในมาตรา
ส่งต่อรองพื้น : 2.55 @ - cccagaagttgaag -
tacttggtgg-3 @ .
กลับหลัก : 5 @ - C C G A T A T T g g -
ggtcttctgtac-3 @ .
2.10 . จำกัดการทดลอง xeld
เมล็ดของพืชรุ่น t0 ( selfed ) ถูกหว่านในกระถางและดิน

ต้นกล้าถูกปลูกถ่ายลงในแผน ( ดินร่วนทรายฟาร์ม
สถาบันวิจัยเกษตรอินเดีย ) วัด 38 ] 31 เมตร ลูกหลานของต้นสาย ( 2
4 ดับ , ,หลัง 10 )
เลือกสำหรับการทดลองพร้อมกับมะเขือเทศปกติพันธุ์ ปุซา
ทับทิม ) สามแถวแต่ละแถว ( ปกติ 4
ทรานสเจนิก ) ถูกฝัง ระหว่างแถวและระหว่างระยะปลูก
90 cm พืชทดสอบถูกล้อมรอบไปด้วย
2 แถวชายแดน ( 5 แยก ) ของพืชมะเขือเทศปกติ
การปฏิบัติทางวัฒนธรรมปกติสำหรับการเพาะปลูกมะเขือเทศเป็น
ตาม ในระหว่างการทดลองไม่มียาฆ่าแมลง
พ่นในแปลง ่มาร์ติ " ของ
พล็อตก็ทำไข่ . armigera . ชิ้น
ผ้ามัสลินที่ H . armigera ไข่ถูก ถูก
เชื่อมโยงกับพืชในเวลาที่# owering . ขั้นตอน
ตามทุกสองสัปดาห์ ข้อมูลเกี่ยวกับ
จำนวนผลความเสียหายครั้งนี้จนจบ
ฤดูปลูกพืช ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสโดยใช้
cry1ac ไพรเมอร์เพื่อระบุ segregants ที่ไม่ได้
นำยีน ของต่างประเทศและผลความเสียหายข้อมูลพืชดังกล่าว
ไม่ได้พิจารณาในช่วง " การวิเคราะห์ระบบ .