Eight bacterial strains were isolat

Eight bacterial strains were isolated from 8 samples of fermented food products including nham (NM), sai-krog-prieo (SS), pla-ra (PR) and kung-chom (KM), collected from various markets in Thailand. The total bacterial cell count ranged from 2.5 x 106-2.35 x 109 CFU/g (Table 1). The isolates NM8-1, PR9-2, PR11-1, KM15-1, NM45-3, SS49-4, SS48-5, SS50-3 were showed lipolytic activity on agar medium. They were Gram-positive, aerobic or facultative anaerobic, spore forming rod-shaped bacteria. Colonies were round, regular or irregular, opaque, flat/smooth or convex and creamy-white after incubation at 37 °C on TSA agar plate for 2 days. They were divided into seven groups based on their phenotypic characteristics and the 16S rRNA gene sequence analyses. All isolates showed positive reaction for catalase, hydrolysis of gelatin and starch, nitrate reduction, Voges-Proskauer (VP) reaction, and Tween 80, growth at 40 °C, and at pH 6-8, but did negative for hydrolysis of arginine, indole, methyl red, urease and hydrogen sulfide formation. All produced acid from D-fructose, D-glucose, but did not produce acid from inulin, D-melezitose, D-melibiose, ∞-methyl-D-glucoside, raffinose, rhamnose, and D-sorbitol. Their differential phenotypic characteristics are described below and in Table 2.
Group 1 contained isolate NM8-1. This isolate grew in 4-6% NaCl, at 45 °C, and pH 9. On the basis of 16S rRNA gene sequence, isolate NM8-1 (1,352 nt) was closely related to B. methylotropicus CBMB 205T (Figure 1) with 99.93% sequence similarity. Therefore, it was identified as B. methylotropicus. However, it was different form B. methylotropicus CBMB 205T in oxidase reaction and growth in 6% NaCl (Madhaiyan et al., 2010).
Group 2 contained isolate PR9-2. It grew at 40 °C. This strain was different from the other strains in citrate utilization, hydrolysis of esculin and acid production from L-arabinose, D-cellobiose, D-mannose, D-ribose, salicin, and D-trehalose (Table 2). On the basis of 16S rRNA gene sequence, isolate PR9-2 (1,382 nt) was closely related to B. pumilus ATCC 7061T (Figure 1) with 100% sequence similarity. Therefore, it was identified as B. pumilus (Satomi et al., 2006).
Group 3 contained isolate PR11-1. It grew in 3% and 5% NaCl, at pH 9 and at 40 °C. This strain was different from the other strains in growth at pH 9, at 40 °C, citrate utilization, hydrolysis of esculin and acid production from D-galactose, D-maltose, D-mannitol and sucrose (Table 2). On the basis of 16S rRNA gene sequence, isolate PR11-1 (1,386 nt) was closely related to B. flexus IFO 15715T (Figure 1) with 100% sequence similarity. Therefore, it was identified as B. flexus (Fergus et al., 1988).
Group 4 contained isolates KM15-1 and SS49-4. These two strains were different in growth in 4-6% NaCl, and some acid production from carbohydrates for each other as in Table 2. Only isolate SS49-4 produced hemolysis. On the basis of 16S rRNA gene sequence, isolates KM15-1 (889 nt) and SS49-4 (1,502 nt) was closely related to B. cereus ATCC 14579T (Figure 1) with 100% sequence similarity. However, they were different from B. cereus strains in some phenotypic characteristics as previously reported (Logan et al., 2002; Yoon and Oh, 2005). In this study, they were identified as B. cereus.
Group 5 contained isolate SS48-5. The strain grew in 8% NaCl, at pH 5-9. It showed almost the same phenotypic characteristics as the type strain of B. subtilis (Lim et al., 2006). On the basis of 16S rRNA gene sequence, isolate SS48-5 (1,481 nt) was closely related to B. subtilis DSM 15029T (Figure 1) with 99.93% sequence similarity. Therefore, it was identified as B. subtilis.
Group 6 contained isolate SS50-3. The strain grew in 6% NaCl, at pH 5-9, and at 45 °C. It produced hemolysin that was different from other strains (Table 2). On the basis of 16S rRNA gene sequence, isolate SS50-3 (1,010 nt) was closely related to B. anthracis ATCC 14578T with 99.9% sequence similarity (Figure 1). The isolate was different from B. anthracis strain in growth 10% NaCl and acid production from D-cellobiose, D-mannose, salicin, and D-xylose as previously reported (Barrow and Feltham, 1993). B. anthracis and B. cereus strains are closely related species, therefore isolate SS50-3 is required to differentiate by molecular identification (Henderson et al., 1994).
Group 7 contained isolate NM45-3. The strain grew at pH 5-9 and 45 °C but did not grow in 4% NaCl. It showed positive reaction for oxidase and hydrolysis of esculin but not gelatin. On the basis of 16S rRNA gene sequence, isolate NM45-3 (1,337 nt) was closely related to P. pasadenensis SAFN-007T (Figure 1) with 99.55% sequence similarity. The strain showed some different in phenotypic characteristics from P. pasadenensis SAFN-007T (Osman et al, 2006). It is required for DNA-DNA hybridization experiment to clarify its taxonomic position at a species level.
The isolates showed lipolytic activity for Tween 20 (0.014±0.129- 0.758±0.009 U/mL), Tween 40 (0.053±0.013-1.322±0.022 U/mL), Tween 60 (0.087±0.005-1.358±0.046 U/mL) and Tween 80 (0.050±0.020-3.231±0.087 U/mL) when they were cultivated in nutrient broth supplemented with Tween 20, Tween 40, Tween 60 and Tween 80, respectively (Table 3). Isolate SS48-5 (Figure 3) produced the highest lipase activity (3.231±0.087 U/mL) as in Table 3. The effects of pH, temperature and incubation time on lipase activity of B. subtilis SS48-5 were carried out. The results revealed that it showed the highest lipase activity (0.82±0.01 U/mL) on Tween 80 at pH 7.5 after incubated for 24 h (Figure 4 ). In addition, the optimum temperature was at 40 °C and the incubation time for lipase production of this strain was 30 h (3.15±0.03 U/ml) and (3.09±0.03 U/ml, Figure 5) 36 h, respectively.
All isolates showed susceptibility to amikacin (30ug), chloramphenicol (30ug), clindamycin (2 µg), erythromycin (15 µg), gentamicin (10 µg), imipenem (10 µg), kanamycin (30 µg), levofoxacin (5 µg), novobiocin (5 µg), streptomycin (10 µg), tetracycline (30 µg) and vancomycin (30 µg). Isolate KM15-1 was resistant to bacitracin (10 U) and penicillin G (20 U), isolate SS49-4 was resistant to penicillin G (20 U), sulphonamide (300 µg) and Bactrim (25 µg) whereas isolate SS503 was resistant to sulphonamide (300 µg) and Bactrim (25 µg) (Table 4). Comparison to the clinical B. cereus strains were resistant to beta-lactam antibiotics and usually susceptible to clindamycin, vancomycin, gentamicin, imipenem, ciprofloxacin, chloramphenicol, and erythromycin whereas many non-B. cereus strains were susceptible to penicillins, semisynthetic penicillins, and cephalosporins (Weber et al., 1988; Drobniewski, 1993).
As mentioned above, our isolates from fermented foods that were closely related to B. methylotropicus, B. pumilus, B. flexus, B. cereus, B. subtilis, B. anthracis and Paenibacillus. The isolates have exhibited lipase activity compared to the strains of B. amylolicefacieus, B. cereus, B. magaterium, B. mesenterichs, B. mycoides, B. popilliae, B. stearothermophilus, B. subtilis as previously reported (Achamma et al., 2003; Gupta et al., 2004; Gayathri, et al., 2013; Miettinen et al., 2013). In nham (fermented pork), the changes in lipid composition and fatty acid profile during fermentation have been reported (Visessanguan et al., 2006). However, a lipolysis of pork fat by bacterial cultures has not been studied in Thailand compared to the meat starter culture Staphylococcus xylosus that was involved in the fermentation (Sørensen,1997). This study was the first report on the lipolytic spore forming Gram-positive bacteria in genera Bacillus and Paenibacillus isolated from Thai fermented foods including nham, sai-krog-prieo, pla-ra and kung-chom

Results (Thai) 1:

8 สายพันธุ์แบคทีเรียที่แยกจากตัวอย่างที่ 8 ผลิตภัณฑ์อาหารหมัก nham (NM), ทราย-krog-เพรียว (SS), ปลาร้า (PR) และกุ้งจอม (KM), รวบรวมจากตลาดต่าง ๆ ในประเทศไทย การนับจำนวนเซลล์แบคทีเรียทั้งหมดอยู่ในช่วงจาก 2.5 x 2.35 แสน 106 x 109 CFU/g (ตารางที่ 1) การแยก NM8-1, PR9-2, PR11-1, KM15 1, NM45-3, SS49-4, SS48-5 SS50 3 ได้เห็นกิจกรรม lipolytic ใน agar ปานกลาง พวกแบคทีเรียแกรมบวก แอโรบิก หรือ facultative ไม่ใช้ออกซิเจน สปอร์แบคทีเรียรูปเหล็กขึ้นรูป อาณานิคมได้รอบ ปกติ หรือผิดปกติ ทึบแสง แบน/เรียบ หรือนูน และสี ขาวครีมหลังจากบ่มที่ 37 ° C บนแผ่น TSA agar 2 วัน พวกเขาถูกแบ่งออกเป็น 7 กลุ่มตามลักษณะของไทป์และ 16S rRNA ยีนลำดับวิเคราะห์ แยกได้ทั้งหมดพบปฏิกิริยาเชิงบวกสำหรับ catalase ไฮโตรไลซ์ตุ๋นแป้ง ลดไนเตรต ปฏิกิริยา Voges Proskauer (VP) และ Tween 80, 40 ° C และ ที่ pH 6-8 การเติบโต แต่ไม่ได้ลบสำหรับไฮโตรไลซ์อาร์จินีน อินโดล สีแดง methyl ผู้แต่งยูและไฮโดรเจนซัลไฟด์ ทั้งหมดผลิตจาก D-ฟรักโทส กรด D-กลูโคส แต่ไม่ได้สร้างกรดจาก inulin, D melezitose, D-melibiose ∞-methyl-D-glucoside, raffinose, rhamnose และซอร์บิทอ ล D อธิบายลักษณะของไทป์แตกต่างด้านล่าง และ ในตารางที่ 2.
1 กลุ่มอยู่แยก NM8 1 แยกนี้เติบโตใน 4-6% NaCl, 45 ° C และค่า pH 9 แยกตาม 16S rRNA ยีนลำดับ NM8-1 (1,352 nt) ที่สัมพันธ์กับการเกิด methylotropicus CBMB 205T (รูปที่ 1) มีความคล้ายคลึงกันของลำดับ 99.93% ดังนั้น มันก็ระบุไว้เป็น methylotropicus เกิด อย่างไรก็ตาม ก็ฟอร์มอื่น CBMB 205T methylotropicus เกิดปฏิกิริยา oxidase และเติบโต 6% NaCl (Madhaiyan et al., 2010)
กลุ่ม 2 ประกอบด้วยแยก PR9-2 จะขยายตัวที่ 40 องศาเซลเซียส นี้ต้องใช้แตกต่างจากสายพันธุ์อื่น ๆ ในการใช้ประโยชน์ซิเตรต ไฮโตรไลซ์ esculin และผลิตกรดจาก L-arabinose, D cellobiose, D-mannose, D-ribose, salicin และ D-trehalose (ตารางที่ 2) แยกตาม 16S rRNA ยีนลำดับ PR9-2 (1,382 nt) ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดให้เกิด pumilus ATCC 7061T (รูปที่ 1) มีความคล้ายคลึงกันของลำดับ 100% ดังนั้น มันก็ระบุไว้เป็นบี pumilus (Satomi et al., 2006) .
PR11 1 แยก 3 กลุ่มที่มีอยู่ มันเติบโต 3% และ 5% NaCl ที่ pH 9 และ 40 องศาเซลเซียส นี้ต้องใช้แตกต่างจากสายพันธุ์อื่นในการเจริญเติบโตที่ pH 9 ที่ 40 ° C ใช้ซิเตรต ไฮโตรไลซ์ esculin และผลิตกรดจาก D-กาแล็กโทส D maltose, D-mannitol และซูโครส (ตารางที่ 2) ตาม 16S rRNA ยีนลำดับ แยก PR11-1 (1386 nt) มีสัมพันธ์ใกล้ชิดกับ flexus เกิด IFO 15715T (รูปที่ 1) มีความคล้ายคลึงกันของลำดับ 100% ดังนั้น มันก็ระบุไว้เป็น flexus เกิด (Fergus et al., 1988) .
4 กลุ่มอยู่แยก KM15 1 และ SS49-4 สายพันธุ์เหล่านี้สองแตกต่างในการเจริญเติบโตใน 4-6% NaCl และบางกรดผลิตจากคาร์โบไฮเดรตสำหรับแต่ละอื่น ๆ ในตารางที่ 2 เฉพาะ SS49 4 แยกผลิต hemolysis แยกตาม 16S rRNA ยีนลำดับ KM15-1 (889 nt) และ SS49-4 (1,502 nt) ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดให้เกิด cereus ATCC 14579T (รูปที่ 1) มีความคล้ายคลึงกันของลำดับ 100% อย่างไรก็ตาม พวกเขาแตกต่างจากสายพันธุ์เกิด cereus ในลักษณะบางไทป์เป็นรายงานไปก่อนหน้านี้ (โลแกนและ al., 2002 จินเกสท์ และ โอ้ 2005) ในการศึกษานี้ พวกเขาระบุเป็น cereus เกิด
กลุ่ม 5 ประกอบด้วยแยก SS48-5 สายพันธุ์เติบโต 8% NaCl ที่ค่า pH 5-9 ก็พบว่าเกือบเดียวกันไทป์ลักษณะเป็นชนิดสายพันธุ์ของ subtilis เกิด (Lim และ al., 2006) แยกตาม 16S rRNA ยีนลำดับ SS48-5 (1,481 nt) ที่สัมพันธ์กับการเกิด subtilis DSM 15029T (รูปที่ 1) มีความคล้ายคลึงกันของลำดับ 99.93% ดังนั้น มันก็ระบุไว้เป็น subtilis เกิด
กลุ่ม 6 อยู่แยก SS50-3 สายพันธุ์เติบโต 6% NaCl ที่ค่า pH 5-9 และ 45 องศาเซลเซียส มันผลิต hemolysin ที่แตกต่างจากสายพันธุ์อื่น (ตารางที่ 2) ตาม 16S rRNA ยีนลำดับ แยก SS50 3 (1,010 nt) มีสัมพันธ์ใกล้ชิดกับเกิด anthracis ATCC 14578T มีความคล้ายคลึงกันของลำดับ 99.9% (รูปที่ 1) แยกไม่แตกต่างจากบี anthracis สายพันธุ์อัตราการเติบโต 10% NaCl และผลิตกรดจาก D cellobiose, D-mannose, salicin และ D xylose เป็นก่อนหน้านี้รายงาน (บาร์โรและ Feltham, 1993) Anthracis เกิดและ cereus เกิดสายพันธุ์เป็นสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด จึง แยก SS50-3 จะต้องแตกต่างจากรหัสโมเลกุล (Henderson et al., 1994) .
NM45-3 แยก 7 กลุ่มที่มีอยู่ พันธุ์โตที่ pH 5-9 และ 45 ° C แต่ไม่เจริญเติบโต 4% NaCl ก็พบว่าเป็นบวกปฏิกิริยา oxidase และไฮโตรไลซ์ esculin แต่ไม่ตุ๋น แยกตาม 16S rRNA ยีนลำดับ NM45-3 (1,337 nt) มีสัมพันธ์ใกล้ชิดกับ P. pasadenensis SAFN-007T (รูปที่ 1) มีความคล้ายคลึงกันของลำดับ 99.55% สายพันธุ์ที่พบแตกต่างกันในลักษณะไทป์บางจากพี pasadenensis SAFN-007T (Osman et al, 2006) จึงจำเป็นสำหรับการทดลองดีเอ็นเอ DNA hybridization ชี้แจงตำแหน่งของอนุกรมวิธานในระดับสายพันธุ์
การแยกพบ lipolytic กิจกรรมสำหรับ Tween 20 (0.014±0.129-0.758±0.009 U/mL), Tween 40 (0.053±0.013-1.322±0.022 U/mL), Tween 60 (0.087±0.005-1.358±0.046 U/mL) และ Tween 80 (0.050±0.020-3.231±0087 U/mL) เมื่อพวกเขาถูกปลูกในธาตุอาหารซุปเสริมกับ Tween 20, Tween 40, Tween 60 และ Tween 80 ตามลำดับ (ตาราง 3) แยก SS48-5 (รูป 3) ผลิตสูงเอนไซม์ไลเปสกิจกรรม (3.231±0.087 U/mL) ในตาราง 3 ผลกระทบของ pH อุณหภูมิ และบ่มเวลากิจกรรมเอนไซม์ไลเปสของ subtilis เกิด SS48-5 ถูกดำเนิน ผลการเปิดเผยว่า ได้เห็นกิจกรรมเอนไซม์ไลเปสสูงสุด (0.82±0.01 U/mL) ใน Tween 80 ที่ pH 7.5 หลังจาก incubated ใน 24 h (4 รูป) มีอุณหภูมิสูงสุดที่ 40 ° C และเวลาฟักตัวในนี้ต้องใช้ผลิตเอนไซม์ไลเปสได้ 30 h (3.15±0.03 U/ml) และ (U/ml, 3.09±0.03 รูปที่ 5) 36 h ตามลำดับ.
ทั้งหมดที่แยกได้พบง่าย amikacin (30ug), chloramphenicol (30ug), clindamycin (ไมโครกรัมเป็นเครื่องที่ 2), erythromycin (15 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง), gentamicin (10 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง), imipenem (10 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง), กานามัยซิน (30 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง), levofoxacin (ไมโครกรัมเป็นเครื่อง 5), novobiocin (ไมโครกรัมเป็นเครื่อง 5), streptomycin (10 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง), เตตราไซคลีน (30 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง) และ vancomycin (30 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง) แยก KM15-1 ถูกทนต่อ bacitracin (10 U) และ G (20 U), SS49-4 แยกยาเพนนิซิลลินก็ทนเพนนิซิลลิน G (20 U), sulphonamide (300 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง) และ Bactrim (25 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง) ในขณะที่ SS503 แยกเป็นทน sulphonamide (300 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง) และ Bactrim (25 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง) (ตาราง 4) เปรียบเทียบกับสายพันธุ์ cereus คลินิกเกิดขึ้นทนต่อยา beta-lactam และมักจะไวต่อการ clindamycin, vancomycin, gentamicin, imipenem, ciprofloxacin, chloramphenicol และ erythromycin ในขณะที่หลายไม่บี สายพันธุ์ cereus ไวต่อ penicillins, semisynthetic penicillins และ cephalosporins (แบ่งแยก et al., 1988 Drobniewski, 1993)
ดังกล่าวข้างต้น เราแยกจากอาหารหมักที่ใกล้ชิดเกี่ยวข้อง การเกิด methylotropicus, pumilus เกิด เกิด flexus, cereus เกิด subtilis เกิด anthracis เกิด Paenibacillus แยกมีการจัดแสดงกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสที่เปรียบเทียบกับสายพันธุ์ของบี amylolicefacieus, cereus เกิด เกิด magaterium, mesenterichs เกิด เกิด mycoides, popilliae เกิด เกิด stearothermophilus, subtilis เกิดเป็นรายงานไปก่อนหน้านี้ (Achamma et al., 2003 กุปตา et al., 2004 กายาตรี et al., 2013 Miettinen et al., 2013) ใน nham (หมูหมัก), การเปลี่ยนแปลงในประวัติองค์ประกอบและกรดไขมันของไขมันในระหว่างการหมักมีการรายงาน (Visessanguan และ al., 2006) อย่างไรก็ตาม ไม่มีการศึกษาผลิตระหว่างประเทศของหมูไขมันแบคทีเรียวัฒนธรรมในประเทศไทยเมื่อเปรียบเทียบกับวัฒนธรรมสตาร์ทเนื้อ xylosus Staphylococcus ที่เกี่ยวข้องกับการหมัก (Sørensen, 1997) การศึกษานี้เป็นรายงานแรกในสปอร์ lipolytic เป็นแบคทีเรียในสกุล Paenibacillus และคัดแยกต่างหากจากอาหารหมักไทยรวม nham ทราย-krog-เพรียว ปลาร้าและกุ้งจอม

Results (Thai) 2:

แปดสายพันธุ์แบคทีเรียที่แยกได้จาก 8 ตัวอย่างของผลิตภัณฑ์อาหารหมักรวมทั้งแหนม (NM) สาย-krog-สุวินทวงศ์ (เอสเอส), ปลาร้า (PR) และ Kung-chom (KM) ที่เก็บจากตลาดในประเทศไทย จำนวนเซลล์แบคทีเรียทั้งหมดตั้งแต่ 2.5 x 106-2.35 x 109 CFU / กรัม (ตารางที่ 1) ไอโซเลท NM8-1, PR9-2, PR11-1, KM15-1, NM45-3, SS49-4, SS48-5, SS50-3 ได้แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการสลายไขมันในอาหารวุ้น พวกเขาเป็นแกรมบวกแอโรบิกแบบไม่ใช้ออกซิเจนหรือตามอำเภอใจ, สร้างสปอร์ของแบคทีเรียรูปแท่ง อาณานิคมเป็นรอบปกติหรือผิดปกติทึบแสงแบน / เรียบหรือนูนและครีมสีขาวหลังจากบ่มที่ 37 ° C ใน TSA จานเลี้ยงเชื้อเป็นเวลา 2 วัน พวกเขาจะถูกแบ่งออกเป็นเจ็ดกลุ่มตามลักษณะฟีโนไทป์ของพวกเขาและยีน 16S rRNA วิเคราะห์ เชื้อทั้งหมดแสดงให้เห็นปฏิกิริยาบวกสำหรับ catalase, การย่อยสลายของเจลาตินและแป้งลดไนเตรต Voges-Proskauer (VP) ปฏิกิริยาและ Tween 80, การเจริญเติบโตที่ 40 ° C และที่พีเอช 6-8 แต่ไม่เชิงลบสำหรับการย่อยสลายของอาร์จินี, อินโดล, สีแดงเมธิล urease และการสร้างไฮโดรเจนซัลไฟด์ ทั้งหมดที่ผลิตจากกรด D-ฟรุกโตส, D-กลูโคส แต่ไม่ได้ผลิตกรดจากอินนูลิน, D-melezitose D-melibiose, ∞-methyl-D-glucoside, raffinose, แรมโนสและซอร์บิทอ D- ลักษณะที่แตกต่างกันฟีโนไทป์ของพวกเขาจะอธิบายไว้ด้านล่างและในตารางที่ 2
กลุ่มที่ 1 มีแยก NM8-1 แยกนี้เติบโต 4-6% โซเดียมคลอไรด์ที่ 45 ° C และ pH 9 บนพื้นฐานของ 16S rRNA ลำดับยีนที่แยก NM8-1 (1,352 NT) เป็นที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับบี methylotropicus CBMB 205T (รูปที่ 1) กับ 99.93% ลำดับที่คล้ายคลึงกัน ดังนั้นจึงถูกระบุว่าเป็นบี methylotropicus อย่างไรก็ตามมันก็ methylotropicus รูปแบบที่แตกต่างกัน B. CBMB 205T ในการทำปฏิกิริยาออกซิเดสและการเจริญเติบโตใน 6% โซเดียมคลอไรด์ (Madhaiyan et al., 2010)
กลุ่มที่ 2 มีแยก PR9-2 มันขยายตัวที่ 40 ° C สายพันธุ์นี้มีความแตกต่างจากสายพันธุ์อื่น ๆ ในการใช้ซิเตรตการย่อยสลายของ esculin และการผลิตกรดจาก L-อราบิโน, D-cellobiose D-mannose, D-น้ำตาล, Salicin และ D-ทรีฮาโล (ตารางที่ 2) บนพื้นฐานของ 16S rRNA ลำดับยีนที่แยก PR9-2 (1,382 NT) เป็นที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ B. pumilus ATCC 7061T (รูปที่ 1) 100% ลำดับที่คล้ายคลึงกัน ดังนั้นจึงถูกระบุว่าเป็น B. pumilus (Satomi et al., 2006)
กลุ่มที่ 3 มีแยก PR11-1 มันขยายตัว 3% และ 5% NaCl, ที่ pH 9 และที่ 40 ° C สายพันธุ์นี้มีความแตกต่างจากสายพันธุ์อื่น ๆ ในการเจริญเติบโตที่ pH 9, ที่ 40 ° C การใช้ซิเตรตการย่อยสลายของ esculin และการผลิตกรดจาก D-กาแลค, D-มอลโตส, D-แมนนิทอลและน้ำตาลซูโครส (ตารางที่ 2) บนพื้นฐานของ 16S rRNA ลำดับยีนที่แยก PR11-1 (1,386 NT) เป็นที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับบี FLEXUS IFO 15715T (รูปที่ 1) 100% ลำดับที่คล้ายคลึงกัน ดังนั้นจึงถูกระบุว่าเป็นบี FLEXUS (เฟอร์กัส et al., 1988)
กลุ่มที่ 4 มีอยู่แยก KM15-1 และ SS49-4 ทั้งสองสายพันธุ์ที่แตกต่างกันในการเจริญเติบโตใน 4-6% โซเดียมคลอไรด์และบางส่วนผลิตกรดจากคาร์โบไฮเดรตสำหรับแต่ละอื่น ๆ ในตารางที่ 2 เพียงเลต SS49-4 ผลิตเม็ดเลือดแดงแตก บนพื้นฐานของ 16S rRNA ลำดับยีนที่แยก KM15-1 (889 NT) และ SS49-4 (1,502 NT) เป็นที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ B. cereus ATCC 14579T (รูปที่ 1) 100% ลำดับที่คล้ายคลึงกัน แต่พวกเขามีความแตกต่างจากสายพันธุ์ B. cereus ในลักษณะฟีโนไทป์บางส่วนตามที่รายงานก่อนหน้านี้ (โลแกน et al, 2002. ยุนและโอ้ 2005) ในการศึกษาครั้งนี้พวกเขาถูกระบุว่าเป็น B. cereus ที่
กลุ่มที่ 5 มีแยก SS48-5 สายพันธุ์ที่เติบโตใน 8% NaCl, ที่ pH 5-9 มันแสดงให้เห็นเกือบลักษณะฟีโนไทป์เดียวกับสายพันธุ์ชนิดของ B. subtilis (ลิ et al., 2006) บนพื้นฐานของ 16S rRNA ลำดับยีนที่แยก SS48-5 (1,481 NT) เป็นที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ B. subtilis DSM 15029T (รูปที่ 1) 99.93% มีความคล้ายคลึงกันตามลำดับ ดังนั้นจึงถูกระบุว่าเป็น B. subtilis
กลุ่มที่ 6 มีแยก SS50-3 สายพันธุ์ที่เติบโต 6% NaCl, ที่ pH 5-9 และ 45 องศาเซลเซียส มันผลิตไลซินเลือดที่แตกต่างจากสายพันธุ์อื่น ๆ (ตารางที่ 2) บนพื้นฐานของ 16S rRNA ลำดับยีนที่แยก SS50-3 (1,010 NT) เป็นที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับบี 14578T anthracis ATCC กับ 99.9% ลำดับที่คล้ายคลึงกัน (รูปที่ 1) แยกแตกต่างจากสายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรียบีในการเจริญเติบโต 10% โซเดียมคลอไรด์และการผลิตกรดจาก D-cellobiose, D-แมนโนส, Salicin และ D-ไซโลตามที่รายงานก่อนหน้านี้ (สาลี่และ Feltham, 1993) B. anthracis และ B. cereus สายพันธุ์ที่มีสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดจึงเลต SS50-3 จะต้องแยกความแตกต่างโดยการระบุโมเลกุล (เฮนเดอ et al., 1994)
กลุ่มที่ 7 มีแยก NM45-3 สายพันธุ์เติบโตที่ pH 5-9 และ 45 องศาเซลเซียส แต่ไม่ได้เติบโตใน 4% โซเดียมคลอไรด์ มันแสดงให้เห็นปฏิกิริยาบวกสำหรับเดสและการย่อยสลายของ esculin แต่ไม่เจลาติน บนพื้นฐานของ 16S rRNA ลำดับยีนที่แยก NM45-3 (1,337 NT) เป็นที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ P. pasadenensis SAFN-007T (รูปที่ 1) 99.55% มีความคล้ายคลึงกันตามลำดับ สายพันธุ์ที่แสดงให้เห็นบางอย่างที่แตกต่างกันในลักษณะฟีโนไทป์จาก P. pasadenensis SAFN-007T (ออสมัน et al, 2006) มันเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการทดลองผสมข้ามพันธุ์ดีเอ็นเอดีเอ็นเอเพื่อชี้แจงตำแหน่งอนุกรมวิธานในระดับสปีชีส์
ที่แยกได้แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการสลายไขมันสำหรับ Tween 20 (0.014 ± 0.129- 0.758 ± 0.009 U / ml) Tween 40 (0.053 ± 0.013-1.322 ± 0.022 U / ml) Tween 60 (0.087 ± 0.005-1.358 ± 0.046 U / ml) และทวีน 80 (0.050 ± 0.020-3.231 ± 0.087 U / ml) เมื่อพวกเขาได้รับการปลูกฝังในน้ำซุปสารอาหารที่เสริมด้วย Tween 20 Tween 40, ทวี 60 และทวีน 80 ตามลำดับ (ตารางที่ 3) แยก SS48-5 (รูปที่ 3) การผลิตเอนไซม์ไลเปสกิจกรรมสูงสุด (3.231 ± 0.087 U / ml) ในขณะที่ในตารางที่ 3 ผลของพีเอชอุณหภูมิและเวลาในการบ่มกับกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปส B. subtilis SS48-5 ได้ดำเนินการ ผลการศึกษาพบว่ามันแสดงให้เห็นว่ากิจกรรมเอนไซม์ไลเปสที่สูงที่สุด (0.82 ± 0.01 U / ml) ในทวีน 80 ที่ pH 7.5 หลังจากบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง (รูปที่ 4) นอกจากนี้อุณหภูมิที่เหมาะสมอยู่ที่ 40 องศาเซลเซียสและเวลาการบ่มสำหรับการผลิตเอนไซม์ไลเปสของสายพันธุ์นี้คือ 30 ชั่วโมง (3.15 ± 0.03 U / ml) และ (3.09 ± 0.03 U / ml รูปที่ 5) 36 ชั่วโมงตามลำดับ
ทั้งหมด แยกความอ่อนแอที่จะแสดงให้เห็น amikacin (30ug) chloramphenicol (30ug), clindamycin (2 ไมโครกรัม), erythromycin (15 ไมโครกรัม), gentamicin (10 ไมโครกรัม), imipenem (10 ไมโครกรัม) KANAMYCIN (30 ไมโครกรัม) levofoxacin (5 ไมโครกรัม) novobiocin (5 ไมโครกรัม), streptomycin (10 ไมโครกรัม) tetracycline (30 ไมโครกรัม) และ vancomycin (30 ไมโครกรัม) แยก KM15-1 เป็นทนต่อ BACITRACIN (10 U) และ penicillin G (20 U), แยก SS49-4 เป็นทนต่อยาปฏิชีวนะ G (20 U), sulphonamide (300 ไมโครกรัม) และ Bactrim (25 ไมโครกรัม) ในขณะที่แยก SS503 ก็ทน เพื่อ sulphonamide (300 ไมโครกรัม) และ Bactrim (25 ไมโครกรัม) (ตารางที่ 4) เมื่อเทียบกับคลินิก B. cereus เป็นสายพันธุ์ที่ทนต่อยาปฏิชีวนะเบต้า lactam และมักจะไวต่อการ clindamycin, vancomycin, gentamicin, imipenem, ciprofloxacin, chloramphenicol และ erythromycin ในขณะที่หลายคนที่ไม่ได้ B สายพันธุ์ cereus มีความไวต่อ penicillins, กึ่งสังเคราะห์ penicillins และ cephalosporins (เวเบอร์ et al, 1988. Drobniewski, 1993)
ดังกล่าวข้างต้นสายพันธุ์ของเราจากอาหารหมักดองที่ได้รับการที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับบี methylotropicus, B. pumilus บี FLEXUS , B. cereus, B. subtilis, B. anthracis และ Paenibacillus สายพันธุ์ได้แสดงกิจกรรมเอนไซม์ไลเปสเมื่อเทียบกับสายพันธุ์ของบี amylolicefacieus, B. cereus บี magaterium บี mesenterichs บี mycoides บี popilliae บี stearothermophilus, B. subtilis ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ (Achamma และคณะ 2003; แคนด์ et al, 2004. Gayathri, et al, 2013.. Miettinen และคณะ, 2013) ในแหนม (หมูหมัก) การเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบของไขมันและกรดไขมันระหว่างการหมักที่ได้รับรายงาน (Visessanguan et al., 2006) อย่างไรก็ตาม lipolysis ของไขมันหมูวัฒนธรรมแบคทีเรียยังไม่ได้รับการศึกษาในประเทศไทยเมื่อเทียบกับเชื้อ Staphylococcus เนื้อ xylosus ที่มีส่วนเกี่ยวข้องในการหมัก (Sørensen, 1997) การศึกษานี้เป็นการรายงานครั้งแรกที่สปอร์สลายไขมันสร้างแบคทีเรียแกรมบวกในจำพวก Bacillus และ Paenibacillus แยกได้จากอาหารหมักของไทยรวมทั้งแหนม, สาย-krog-สุวินทวงศ์ปลาร้าและ Kung-chom

Results (Thai) 3:

8 สายพันธุ์แบคทีเรียที่แยกได้จาก 8 ตัวอย่างของผลิตภัณฑ์อาหารหมัก ได้แก่ แหนม ( nm ) , ไทร krog เปรี้ยว ( SS ) , ปลาร้า ( PR ) และกุ้งจอม ( km ) ที่รวบรวมได้จากตลาดต่าง ๆในประเทศไทย รวมนับเซลล์แบคทีเรียอยู่ระหว่าง 2.5 x 106-2.35 x 109 CFU / g ( ตารางที่ 1 ) ที่แยกได้ nm8-1 pr9-2 pr11-1 km15-1 , , , nm45-3 ss49-4 ss48-5 , , , ,ss50-3 ปรากฏว่ากิจกรรมกับบนอาหารวุ้น . พวกแกรมบวก แอโรบิก หรือธุวมณฑล การขึ้น rod-shaped แบคทีเรียสร้างสปอร์ อาณานิคมรอบปกติหรือผิดปกติ , ขุ่น , แบนเรียบหรือนูน และสีขาวนวล หลังจากบ่มที่ 37 ° C บน TSA agar plate 2 วันแบ่งออกเป็น 7 กลุ่ม ตามลักษณะฟีโนไทป์ของยีน 16S rRNA ลำดับและวิเคราะห์ข้อมูล ทุกสายพันธุ์มีปฏิกิริยาในเชิงบวกสำหรับ Catalase , การย่อยสลายของเจลาตินและแป้ง ลดไนเตรท Voges proskauer ( VP ) ปฏิกิริยาและสารทวีน 80 , การเจริญเติบโตที่ 40 ° C และ pH 6-8 แต่ไม่ได้ลบสำหรับการย่อยสลายของอาร์อินโดล เมทิลเรดที่มีการเกิดก๊าซไฮโดรเจนซัลไฟด์ . ทั้งหมดผลิตกรดจาก d-fructose ดี กูลโคส , แต่ไม่ได้สร้างกรดจาก d-melezitose d-melibiose ∞อินนูลิน , , , - methyl-d-glucoside แรฟฟิโนส rhamnose , , , และ d-sorbitol . ค่าคุณสมบัติลักษณะของพวกเขาจะอธิบายด้านล่างและตาราง 2 .
1 กลุ่มมีแยก nm8-1 . นี้แยกขึ้นใน 4-6 % NaCl ที่ 45 ° C และ pH 9บนพื้นฐานของยีน 16S rRNA ลำดับแยก nm8-1 ( กำ NT ) คือเกี่ยวข้องกับ บี methylotropicus cbmb 205t ( รูปที่ 1 ) กับ 99.93 % ดับที่คล้ายคลึงกัน ดังนั้น มันถูกระบุว่าเป็น บี methylotropicus . แต่มันต่างกันแบบ ข. methylotropicus cbmb 205t ในปฏิกิริยาเอนไซม์และการเจริญเติบโตใน 6 % NaCl ( madhaiyan et al . , 2010 )
กลุ่ม 2 มีแยก pr9-2 . มันเริ่มที่ 40 ° Cสายพันธุ์นี้ แตกต่างจากสายพันธุ์อื่นในการใช้ซิเตรต การย่อยสลายของ esculin และการผลิตกรดจาก l-arabinose d-cellobiose ดี แมนโนส d-ribose , , , , ซาลิซิน และ d-trehalose ( ตารางที่ 2 ) บนพื้นฐานของยีน 16S rRNA ลำดับแยก pr9-2 ( 947 NT ) คือที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับบี ลลั ูมิลุส ATCC 7061t ( รูปที่ 1 ) 100% ดับที่คล้ายคลึงกัน ดังนั้น มันถูกระบุว่าเป็น พ.ลลั ูมิลุส ( ซาโตมิ et al . , 2006 ) .
3 กลุ่มประกอบด้วยแยก pr11-1 . มันเติบโต 3 % และ 5 % NaCl ที่ pH 9 ที่อุณหภูมิ 40 องศา สายพันธุ์นี้ แตกต่างจากสายพันธุ์อื่นในการเจริญเติบโตที่ pH 9 ที่อุณหภูมิ 40 องศา C , ซิเตรต การใช้ การ esculin และการผลิตกรดจาก d-galactose d-maltose d-mannitol , , และซูโครส ( ตารางที่ 2 ) บนพื้นฐานของยีน 16S rRNA ลำดับแยก pr11-1 ( 1386 NT ) คือที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดเพื่อ flexus IFO 15715t ( รูปที่ 1 ) 100% ดับที่คล้ายคลึงกัน ดังนั้น มันถูกระบุว่าเป็น บี flexus ( เฟอร์กัส et al . , 1988 )
4 ไอโซเลท และกลุ่มที่มี km15-1 ss49-4 . เหล่านี้สองสายพันธุ์ที่แตกต่างกันในการเจริญเติบโตใน 4-6 % NaCl และการผลิตกรดจากคาร์โบไฮเดรตสำหรับแต่ละอื่น ๆ ในตารางที่ 2 แค่แยก ss49-4 ผลิตได .บนพื้นฐานของ 16S rRNA ยีน ลำดับ จาก km15-1 ( 889 NT ) และ ss49-4 ( 1502 NT ) คือที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ B . cereus ATCC 14579t ( รูปที่ 1 ) 100% ดับที่คล้ายคลึงกัน อย่างไรก็ตาม พวกเขาแตกต่างจาก B . cereus สายพันธุ์ในบางลักษณะฟีโนไทป์ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ ( โลแกน et al . , 2002 ; และยุนโอ , 2005 ) ในการศึกษานี้ จะระบุเป็น B . cereus .
กลุ่มที่ 5 ประกอบด้วยแยก ss48-5 . ความเครียดจากเกลือโซเดียมคลอไรด์ร้อยละ 8 ที่ pH 5-9 . มันแสดงให้เห็นว่าเกือบเดียวกันคุณสมบัติลักษณะเป็นชนิดสายพันธุ์ของ B . subtilis ( ลิม et al . , 2006 ) บนพื้นฐานของยีน 16S rRNA ลำดับแยก ss48-5 ( 481 NT ) คือที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ B . subtilis DSM 15029t ( รูปที่ 1 ) กับ 99.93 % ดับที่คล้ายคลึงกัน ดังนั้น มันถูกระบุว่าเป็น B . subtilis .
กลุ่มที่ 6 ประกอบด้วยแยก ss50-3 . สายพันธุ์ที่เติบโต 6% เกลือที่ pH 5-9 และ 45 องศา มันผลิตซีรัมที่แตกต่างจากสายพันธุ์อื่น ( ตารางที่ 2 ) บนพื้นฐานของยีน 16S rRNA ลำดับแยก ss50-3 ( 1010 NT ) คือที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับบีแอนแทรกซ์ ATCC 14578t กับ 99.9% ความเหมือนของลำดับ ( รูปที่ 1 ) แยกแตกต่างจาก Bแอนแทรกซ์เมื่อยในเกลือแกง 10% การเจริญและการผลิตกรดจาก d-cellobiose ดี แมนโนส และ d-xylose ซาลิซิน , , , ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ ( รถเข็น และ feltham , 1993 ) B และ B . cereus สายพันธุ์แอนแทรกซ์เป็นสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด จึงแยก ss50-3 ต้องแยกแยะโดยการระบุโมเลกุล ( Henderson et al . , 1994 ) .
กลุ่ม 7 มีแยก nm45-3 .สายพันธุ์ที่เติบโตที่ pH 5-9 และ 45 ° C แต่ไม่เติบโต 4 % เกลือ มันมีปฏิกิริยาบวกกับ oxidase และการย่อยสลายของ esculin แต่ไม่ใช่เจลาติน บนพื้นฐานของยีน 16S rRNA ลำดับแยก nm45-3 ( 1337 NT ) คือที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับหน้า pasadenensis safn-007t ( รูปที่ 1 ) กับ 99.55 % ดับที่คล้ายคลึงกัน สายพันธุ์ที่พบในลักษณะฟีโนไทป์แตกต่างจาก Ppasadenensis safn-007t ( อุสมาน et al , 2006 ) มันเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการทำ dna-dna ทดลองชี้แจงตำแหน่งทางอนุกรมวิธานของในระดับชนิด ไอโซเลทเมื่อ
กับกิจกรรม Tween 20 ( 0.014 ± 0.129 - 0.758 ± 0.009 U / ml ) Tween 40 ( 0.053 ± 0.013-1.322 ± 0.022 U / ml ) Tween 60 ( 0.087 ± 0.005-1.358 ± ( U / ml ) ทวีน 80 ( 0.050 ± 0.020-3.231 ± 0087 U / ml ) เมื่อพวกเขาถูกเลี้ยงใน broth ธาตุอาหารเสริมทวีน 20 , Tween 40 , ทวีน 80 60 ตามลำดับ ( ตารางที่ 3 ) แยก ss48-5 ( รูปที่ 3 ) ผลิตกิจกรรมเอนไซม์ไลเปสสูงสุด ( 3.231 ± 0.087 U / ml ) เป็นตารางที่ 3 ผลของพีเอช อุณหภูมิและเวลาในการบ่มในไลเปสของ B . subtilis ss48-5 พบว่าผลการศึกษา พบว่า มีกิจกรรมเอนไซม์ไลเปสสูงสุด ( 0.82 ± 0.01 U / ml ) Tween 80 ที่ pH 7.5 และหลังจากบ่มเชื้อเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ( รูปที่ 4 ) นอกจากนี้ อุณหภูมิที่เหมาะสมอยู่ที่ 40 ° C และเวลาในการบ่มเพื่อการผลิตไลเปสของสายพันธุ์นี้คือ 30 H ( 3.15 ± 0.03 U / ml ) และ ( 3.09 ± 0.03 U / ml รูปที่ 5 ) 36 ชั่วโมง ตามลำดับ พบว่าทุกสายพันธุ์
รวบรวมยา ( 30ug )คลอแรมเฟนิคอล ( 30ug ) คลินดามัยซิน ( 2 µกรัม ) , อีริโทรไมซิน ( µ 15 กรัม ) เจนตาไมซิน ( µ 10 กรัม ) อิมิพีเนม ( µ 10 กรัม ) , kanamycin ( µ 30 กรัม ) , levofoxacin ( 5 µ G ) โนโวไบโอซิน ( 5 µกรัม ) , สเตร็ปโตมัยซิน ( µ 10 กรัม ) , เตตราไซคลิน ( µ 30 กรัม ) และแวนโคมัยซิน ( µ 30 กรัม ) แยก km15-1 คือทนต่อ Bacitracin ( 10 U ) และ penicillin G ( 20 U ) , แยก ss49-4 คือทนต่อ penicillin G ( 20 U )ซัลโฟนาไมด์ ( µ 300 กรัม และแบคทริม ( µ 25 กรัม ) ส่วนแยก ss503 คือทนต่อซัลโฟนาไมด์ ( µ 300 กรัม และแบคทริม ( µ 25 กรัม ) ( ตารางที่ 4 ) เปรียบเทียบกับคลินิก B . cereus สายพันธุ์ที่ทนต่อยาในกลุ่มเบต้าแลคแตมและมักจะไวต่อยาคลินดามัยซิน , ได้ยาไซโปรฟลอกซาซินอิมิพีเนม , , , , และในขณะที่หลาย non-b. ซินอลสายพันธุ์เชื้อมีความไวต่อยาปฏิชีวนะเพนิซิลลินและ semisynthetic , , เซฟาโลสปอริน ( Weber et al . , 1988 ; drobniewski , 1993 )
ดังกล่าวข้างต้น ของเราที่แยกได้จากอาหารที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดเพื่อ methylotropicus บี ลลั ูมิลุส พ. flexus , B . cereus , B . subtilis หมัก , B และแอนแทรกซ์ paenibacillus . ที่แยกได้มีการจัดแสดงไลเปสเมื่อเทียบกับสายพันธุ์ของamylolicefacieus , B . cereus B magaterium พ. mesenterichs พ. mycoides พ. popilliae พ. stearothermophilus , B . subtilis ตามที่รายงานก่อนหน้านี้ ( achamma et al . , 2003 ; Gupta et al . , 2004 ; gayathri , et al . , 2013 ; miettinen et al . , 2013 ) แหนม ( แหนม ) , การเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบของไขมันและกรดไขมันในโปรไฟล์ของการหมักมีการรายงาน ( visessanguan et al . , 2006 ) อย่างไรก็ตามมีไลโปไลซิสของไขมันหมูโดยวัฒนธรรมแบคทีเรียไม่ได้รับการศึกษาในประเทศไทยเมื่อเปรียบเทียบกับเนื้อกล้าเชื้อ Staphylococcus xylosus ที่เกี่ยวข้องในการหมัก ( S ขึ้น rensen , 1997 ) การศึกษานี้รายงานแรกที่เป็นแบคทีเรียกรัมบวกกับสปอร์บาซิลลัสในสกุลและที่แยกได้จากอาหารหมักไทย paenibacillus ได้แก่ แหนมเปรี้ยว krog ทราย ,ปลาร้า และเหล่าจอม