Lysozyme is a positively charged, b

Lysozyme is a positively charged, basic protein under a reasonably neutral pH. In order to maintain this characteristic for ion-exchange chromatography, we will dialyze against a tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) buffer. An effective buffer over a pH range of ~6.5 to 9.7, Tris is the most commonly used buffer in biological research because it is the only inexpensive compound with a pKa in the slightly alkaline pH range. The majority of primary amines have pKa values greater than 9.0, but due to the strong electron withdrawing power of the three hydroxyl groups present on the methylene substitutents of Tris, the pKa of this buffer is ~8.0 at 25oC and optimal for our protein.

In a more general sense, dialyzing against a buffer is advantageous for a variety of reasons. Other than controlling both the salt concentration and pH, and therefore protecting our protein from denaturation, dialysis is often preformed against a buffer to prepare for the next step. Dialyzing against a buffer therefore not only removes the salt from our solution and prevents denaturation, but places the protein in the buffer needed for the next step in an experiment.

The last step in our extraction of lysozyme is centrifugation. During dialysis, some biological molecules (lipids, carbohydrates, etc.) will precipitate out of solution, and if these particles are not removed there is a chance they may interfere with the next step. In particular for our experiment, if the precipitates are not removed before ion-exchange there is a chance that they may clog the column and prevent the separation from working effectively. Thus, we must centrifuge our sample prior to this step in order to eliminate any potential risk.

Once the smaller solute molecules have been removed from our sample, we can then begin to separate the larger molecules by a form of ion-exchange chromatography. Ion-exchange is a separation technique utilized for nearly all kinds of charged molecules including large proteins, nucleotides, and even amino acids. The principle behind this technique is based on Coulombic interactions between the sample and the matrix. Specifically, the matrix, which is most commonly cellulose- and agarose-based resin, is coated with ionic functional groups capable of interacting with molecules exhibiting groups of opposing charges.

Overall, there are two major types of ion-exchange: (1) cation-exchange; and (2) anion-exchange. In cation-exchange, the matrix is coated with negatively charged functional groups (i.e. carboxymethyl (CM); —CH2COO-) in order to retain cations, while positively charged groups are utilized to retain anions (i.e. diethylaminoethyl (DEAE) (—CH2CH2NH(CH2CH3)2+). In this portion of the experiment we will be utilizing the cation-exchanger CM-Sephadex-25 which will effectively separate the positively charged lysozyme from molecules of negative and neutral charge.

Results (Thai) 1:

Lysozyme เป็นโปรตีนที่คิดค่าธรรมเนียมบวก พื้นฐานภายใต้ค่า pH เป็นกลางสมเหตุสมผล การรักษาลักษณะนี้สำหรับการแลกเปลี่ยนไอออน chromatography เราจะ dialyze กับบัฟเฟอร์ aminomethane (ตรี) ตรี (hydroxymethyl) บัฟเฟอร์ที่มีประสิทธิภาพช่วง pH ของ ~6.5 ไป 9.7 ทริสเรทติ้งเป็นที่ใช้บัฟเฟอร์ในการวิจัยทางชีวภาพเนื่องจากเป็นสารประกอบที่ไม่แพงเท่ากับ pKa ในช่วง pH ด่างเล็กน้อย Amines หลักส่วนใหญ่มีค่า pKa มากกว่า 9.0 แต่แข็งแรงอิเล็กตรอน withdrawing อำนาจของสามไฮดรอกซิลกลุ่มอยู่ใน substitutents เมทิลีนไดของทริสเรทติ้ง pKa บัฟเฟอร์นี้เป็น ~8.0 ที่ 25oC และเหมาะสมสำหรับโปรตีนของเราในความรู้สึกทั่วไป dialyzing กับบัฟเฟอร์ได้ประโยชน์หลายประการ การควบคุมความเข้มข้นเกลือและ pH และดังนั้นจึง ปกป้องโปรตีนของเราจาก denaturation หน่วยเป็นมักจะสามารถ preformed กับบัฟเฟอร์เพื่อเตรียมความพร้อมสำหรับขั้นตอนถัดไป Dialyzing กับบัฟเฟอร์จึงไม่เพียงแต่เอาเกลือจากโซลูชันของเรา และป้องกันการ denaturation ได้ใส่โปรตีนในบัฟเฟอร์ที่จำเป็นสำหรับขั้นตอนถัดไปในการทดลองขั้นตอนสุดท้ายของเราสกัด lysozyme เป็น centrifugation ระหว่างหน่วย บางโมเลกุลชีวภาพ (โครงการ คาร์โบไฮเดรต ฯลฯ) จะ precipitate จากโซลูชั่น และถ้าอนุภาคเหล่านี้ออกไป เป็นโอกาสที่พวกเขาอาจส่งผลต่อขั้นตอนถัดไป โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ในการทดลองของเรา ถ้า precipitates ออกไปก่อน สารกรองมีได้โอกาสที่พวกเขาอาจอุดตันคอลัมน์ และป้องกันไม่ให้แยกจากการทำงานอย่างมีประสิทธิภาพ ดังนั้น เราต้อง centrifuge ตัวอย่างของเราก่อนขั้นตอนนี้เพื่อขจัดความเสี่ยงใด ๆ ที่อาจเกิดขึ้นเมื่อโมเลกุลของตัวถูกละลายขนาดเล็กจะถูกเอาออกจากตัวอย่างของเรา จากนั้นเราจะเริ่มแยกโมเลกุลใหญ่ โดยรูปแบบของการแลกเปลี่ยนไอออน chromatography แลกเปลี่ยนไอออนเป็นเทคนิคแยกใช้สำหรับการคิดค่าธรรมเนียมโมเลกุลโปรตีนขนาดใหญ่ นิวคลีโอไทด์ และกรดอะมิโนได้เกือบทุกชนิด หลักการเบื้องหลังเทคนิคนี้ขึ้นอยู่กับ Coulombic การโต้ตอบระหว่างตัวอย่างและเมตริกซ์ โดยเฉพาะ เมตริกซ์ ซึ่งมักใช้เซลลูโลส และ agarose เรซิ่น เคลือบ ด้วย ionic functional กลุ่มความสามารถในการโต้ตอบกับโมเลกุลอย่างมีระดับกลุ่มค่าธรรมเนียมที่ฝ่ายตรงข้ามโดยรวม มีสองประเภทหลักของการแลกเปลี่ยนไอออน: cation (1) -แลก และ anion exchange (2) ใน cation exchange เมตริกซ์จะเคลือบ ด้วยกลุ่ม functional ส่งชำระ (เช่น carboxymethyl (CM); — CH2COO-) เพื่อเก็บไว้เป็นของหายาก ในขณะที่กลุ่มที่คิดค่าธรรมเนียมบวกถูกนำมาใช้รักษา anions (เช่น diethylaminoethyl (DEAE) (— CH2CH2NH(CH2CH3)2+) ในส่วนของการทดลองนี้ เราจะสามารถใช้ที่ cation-ถ่าย CM-Sephadex-25 ซึ่งจะแยก lysozyme บวกคิดค่าธรรมเนียมจากโมเลกุลของค่าลบ และเป็นกลางได้อย่างมีประสิทธิภาพ

Results (Thai) 2:

ไลโซไซม์เป็นประจุบวกโปรตีนพื้นฐานภายใต้ค่า pH เป็นกลางพอสมควร เพื่อที่จะรักษาลักษณะนี้ได้โคแลกเปลี่ยนไอออนเราจะ dialyze กับ tris (hydroxymethyl) aminomethane (ทริส) บัฟเฟอร์ บัฟเฟอร์ที่มีประสิทธิภาพในช่วง pH ของ ~ 6.5-9.7 ที่ทริสเป็นบัฟเฟอร์ที่ใช้กันมากที่สุดในการวิจัยทางชีววิทยาเพราะมันเป็นเพียงสารที่มีราคาไม่แพง pKa อยู่ในช่วง pH ด่างเล็กน้อย ส่วนใหญ่ของเอมีนหลักมีค่า pKa มากกว่า 9.0 แต่เนื่องจากการใช้พลังงานอิเล็กตรอนถอนตัวที่แข็งแกร่งของทั้งสามกลุ่มไฮดรอกอยู่บน substitutents เมทิลีนทริสที่ pKa ของบัฟเฟอร์นี้ ~ 8.0 ที่ 25oC และดีที่สุดสำหรับโปรตีนของเรา. ใน ความรู้สึกทั่วไปมากขึ้น dialyzing กับกันชนเป็นประโยชน์สำหรับหลากหลายเหตุผล นอกเหนือจากการควบคุมทั้งความเข้มข้นของเกลือและพีเอชและดังนั้นจึงปกป้องเราจากโปรตีน denaturation, ไตมักจะ preformed กับกันชนที่จะเตรียมความพร้อมสำหรับขั้นตอนต่อไป Dialyzing กับกันชนจึงไม่เพียง แต่เอาเกลือจากการแก้ปัญหาของเราและป้องกันการสูญเสียสภาพธรรมชาติ แต่สถานที่โปรตีนในบัฟเฟอร์ที่จำเป็นสำหรับขั้นตอนต่อไปในการทดลอง. ขั้นตอนสุดท้ายในการสกัดของไลโซไซม์คือการหมุนเหวี่ยง ในระหว่างการฟอกเลือดบางชีววิทยาโมเลกุล (ไขมันคาร์โบไฮเดรตและอื่น ๆ ) จะเกิดการตกตะกอนออกมาของการแก้ปัญหาและถ้าอนุภาคเหล่านี้จะไม่ถูกลบมีโอกาสที่พวกเขาอาจจะยุ่งเกี่ยวกับขั้นตอนต่อไป โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการทดสอบของเราถ้าตกตะกอนจะไม่ถูกลบออกก่อนที่จะแลกเปลี่ยนไอออนมีโอกาสที่พวกเขาอาจเกิดการอุดตันคอลัมน์และป้องกันไม่ให้เกิดการแยกการทำงานได้อย่างมีประสิทธิภาพจาก ดังนั้นเราจึงต้องหมุนเหวี่ยงตัวอย่างของเราก่อนที่จะมีขั้นตอนนี้เพื่อที่จะขจัดความเสี่ยงที่อาจเกิดขึ้น. เมื่อโมเลกุลของตัวถูกละลายที่มีขนาดเล็กได้ถูกลบออกจากตัวอย่างของเราเราก็สามารถเริ่มต้นที่จะแยกโมเลกุลขนาดใหญ่โดยรูปแบบของโคไอออนแลกเปลี่ยน แลกเปลี่ยนไอออนเป็นเทคนิคที่ใช้ในการแยกชนิดเกือบทั้งหมดของโมเลกุลโปรตีนรวมทั้งค่าใช้จ่ายที่มีขนาดใหญ่นิวคลีโอและแม้กระทั่งกรดอะมิโน หลักการที่อยู่เบื้องหลังเทคนิคนี้จะขึ้นอยู่กับการมีปฏิสัมพันธ์ระหว่าง Coulombic ตัวอย่างและเมทริกซ์ โดยเฉพาะแมทริกซ์ซึ่งเป็นกันมากที่สุดและ cellulose- agarose ตามเรซินเคลือบด้วยการทำงานเป็นกลุ่มอิออนมีความสามารถในการมีปฏิสัมพันธ์กับโมเลกุลแสดงกลุ่มของค่าใช้จ่ายของฝ่ายตรงข้าม. โดยรวมมีสองประเภทหลักของแลกเปลี่ยนไอออน (1) ไอออนบวก -exchange; และ (2) ไอออนแลกเปลี่ยน ในการแลกเปลี่ยนไอออนบวกเมทริกซ์ที่มีการเคลือบด้วยประจุลบการทำงานเป็นกลุ่ม (เช่นคาร์บอกซี (CM); -CH2COO-) เพื่อที่จะรักษาไพเพอร์ในขณะที่กลุ่มที่มีประจุบวกถูกนำมาใช้ในการรักษาแอนไอออน (เช่น diethylaminoethyl (ดีอีเออี) (-CH2CH2NH ( CH2CH3) 2 +). ในส่วนนี้ของการทดลองเราจะใช้แลกเปลี่ยนไอออนบวก-CM-Sephadex-25 มีประสิทธิภาพซึ่งจะแยก lysozyme ประจุบวกจากโมเลกุลของประจุลบและเป็นกลาง

Results (Thai) 3:

ไลโซไซม์เป็นประจุบวก โปรตีนพื้นฐานภายใต้ pH เป็นกลางพอสมควร เพื่อรักษาลักษณะนี้สำหรับโครมาโตกราฟีไอออน เราจะ dialyze กับทริส ( ซี ) การใช้เสียงระดับต่ำ ( ทริส ) กันชน ที่มีประสิทธิภาพมากกว่าบัฟเฟอร์ pH ในช่วง ~ 6.5 9.7 ,ทริสบัฟเฟอร์ที่ใช้บ่อยที่สุดในการวิจัยทางชีวภาพ เพราะมันเป็นเพียงราคาไม่แพง ผสมกับความด่างเล็กน้อย ค่า pH ในช่วง . ส่วนใหญ่ของเอมีนปฐมภูมิมีคุณค่า pKa มากกว่า 9.0 แต่เนื่องจากอิเล็กตรอนถอนแรงพลังของ 3 หมู่ไฮดรอกซิลปัจจุบันใน 4 substitutents ของบริษัท , pKa ของบัฟเฟอร์นี้ ~ 80 ที่ 25oc และเหมาะสมที่สุดสำหรับโปรตีนของเรา

ในความรู้สึกทั่วไปมากขึ้น dialyzing กับบัฟเฟอร์เป็นประโยชน์สำหรับความหลากหลายของเหตุผล นอกจากการควบคุมทั้งความเข้มข้นเกลือและความเป็นกรด - ด่าง และดังนั้นจึง ปกป้องเราจากโปรตีน ( การฟอกเลือดมักจะเป็น preformed กับบัฟเฟอร์เพื่อเตรียมพร้อมสำหรับขั้นตอนต่อไปdialyzing กับบัฟเฟอร์จึงไม่เพียง แต่ขจัดเกลือออกจากสารละลายของเราและป้องกันการหยุดชั่วคราว แต่สถานที่โปรตีนในบัฟเฟอร์ที่จำเป็นสำหรับขั้นตอนต่อไปในการทดลอง

ขั้นตอนสุดท้ายในการสกัดของไลโซไซม์คือการปั่นเหวี่ยง ระหว่างล้างไต บางทางชีวภาพโมเลกุลลิพิด คาร์โบไฮเดรต ฯลฯ ) จะตกตะกอนจากสารละลายและถ้าอนุภาคเหล่านี้จะไม่ลบออก มีโอกาส อาจรบกวน ในขั้นตอนต่อไป โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการทดลองของเรา ถ้าตะกอนจะไม่ถูกลบออกก่อนที่ลูกมีโอกาสที่พวกเขาอาจเกิดการอุดตัน และป้องกันการแยกคอลัมน์จากการทำงานได้อย่างมีประสิทธิภาพ ดังนั้น เราต้องปั่นเหวี่ยงตัวอย่างของเราก่อนขั้นตอนนี้เพื่อขจัดความเสี่ยงที่อาจเกิดขึ้นใด ๆ .

เมื่อโมเลกุลของตัวทำละลายที่มีขนาดเล็กได้ถูกลบออกจากตัวอย่างของเรา เราสามารถเริ่มต้นการแยกโมเลกุลขนาดใหญ่ โดยรูปแบบของไอออนโครมาโตกราฟี . การแลกเปลี่ยนไอออนเป็นเทคนิคที่ใช้แยกสำหรับเกือบทุกชนิดของค่าใช้จ่ายรวมทั้งโปรตีนโมเลกุลใหญ่เบสและกรดอะมิโนหลักการที่อยู่เบื้องหลังเทคนิคนี้จะขึ้นอยู่กับการโต้ตอบ coulombic ระหว่างตัวอย่างและเมทริกซ์ โดยเฉพาะ เมทริกซ์ ซึ่งมักมีเซลลูโลสและเคลือบด้วยเรซินที่ใช้ , , การทำงานกลุ่มไอออนสามารถมีปฏิสัมพันธ์กับโมเลกุล ซึ่งกลุ่มของฝ่ายตรงข้ามที่ค่า

โดยรวมแล้วมีสองประเภทหลักของการแลกเปลี่ยนไอออน ( 1 ) แลกเปลี่ยนประจุ ;( 2 ) แลกเปลี่ยนแอนไอออน . ในการแลกเปลี่ยนประจุบวก , เมทริกซ์เคลือบด้วยซึ่งมีประจุลบ ( คือหมู่ฟังก์ชันคาร์บอกซีเมทธิล ( ซม. ) ; - ch2coo - ) ในการรักษาชนิดมีประจุบวก ในขณะที่กลุ่มที่ใช้รักษาหูดหงอนไก่ ( เช่น diethylaminoethyl ( DEAE ) ( - ch2ch2nh ( ch2ch3 ) 2 )ในส่วนของการทดลอง เราจะใช้แลกเปลี่ยนไอออนบวก cm-sephadex-25 ซึ่งมีประสิทธิภาพจะแยกไลโซไซม์จากโมเลกุลของประจุบวกและลบประจุเป็นกลาง .