2. Materials and methods2.1. Protei

2. Materials and methods
2.1. Protein production and characterization
As the expression level of the Cry1Ab/Ac protein in transgenic rice is extremely
low, it is preferable to conduct safety studies with Cry1Ab/Ac protein produced in
E. coli. The level of Cry1Ab/Ac protein expression was typically

Results (Thai) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 ผลิตโปรตีนและสมบัตินิพจน์ที่ระดับของโปรตีน Cry1Ab/Ac ในข้าวถั่วเหลืองเป็นอย่างมากต่ำ จะใช้เพื่อดำเนินการศึกษาความปลอดภัยกับโปรตีน Cry1Ab/Ac ผลิตในE. coli ระดับ Cry1Ab/Ac โปรตีนนิพจน์ปกติ < 3 มก.กก. 1 ข้าววัสดุ (Cry1Ab/Ac โปรตีนในข้าวถูกทดสอบโดย Envirologix Cry1Ab/Cry1AcKit.), และจำนวนโปรตีนบริสุทธิ์จากข้าวทดสอบสัตว์ที่อุดมสมบูรณ์จะมีเทคนิคมาก คุณสมบัติที่เหมาะสมของเทียบเท่าระหว่างrecombinant โปรตีนและข้าวที่แสดงโปรตีนมีความจำเป็นเป็นแบบ requisite ก่อนสำหรับการใช้ในการประเมินความปลอดภัยเพื่อสนับสนุนกิจกรรมเฉพาะถั่วเหลือง2.1.1 ฟอกโปรตีนจากถั่วเหลืองข้าวทิ้งโปรตีน Cry1Ab/Ac ที่บริสุทธิ์จากดินในครกใบข้าวแช่prechilled กับไนโตรเจนเหลว สารสกัดที่เตรียม โดยผสมดินใบไม้มีบัฟเฟอร์สกัดอัตราส่วน 1:10 สารสกัดได้ centrifuged ที่12000 rpm สำหรับ 10 นาที และต่อ ขึ้ โดยการกรองผ่านตัวกรอง nitrocellulose การโปรตีน Cry1Ab/Ac แยกได้บริสุทธิ์ โดย chromatography ความสัมพันธ์เพิ่มเติมใช้แอนตี้ต่อต้าน-Cry1Ab/Ac กระต่ายบริสุทธิ์ แอนติบอดีต่อต้าน-Cry1Ab/Acคอลัมน์ความสัมพันธ์จะใช้ชุด (เพียร์ซ หมายเลขผลิตภัณฑ์ 44894) ตามให้คำแนะนำของผู้ผลิต สารสกัดที่สามารถไหลผ่านได้อย่างอิสระคอลัมน์จนอิ่มตัว และโปรตีนถูก eluted จากคอลัมน์แอนติบอดีตามคำแนะนำของผู้ผลิต2.1.2 การนิพจน์และทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีน Cry1Ab/Ac จาก E. coliPET-30a (+) -Cry1ab/ac-rcp-BL21 (DE3) (ห้องปฏิบัติการอาหารปลอดภัย เคา ปักกิ่งจีน) ถูกใช้ในการแสดงสูงโปรตีน Cry1Ab/Ac Cry1ab/ac-rcp (GenBankหมายเลขทะเบียน EU816953) เรียกว่ายีน Cry1ab/ac ปรับเปลี่ยนการแสดงใน E. coli และทั้งสองอย่างเข้าตามลำดับกรดอะมิโน ที่Cry1Ab/Ac อาหารโปรตีนได้แสดงดังนี้: 6 mL ของแอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์เติบโตขึ้นวัฒนธรรมเพิ่มปานกลาง 200 มล และ incubated ด้วยการสั่นที่คึกคักค. 37 ที่ OD600 = 0.6 – 1.0 ของวัฒนธรรม นิพจน์โปรตีนถูกทำให้เกิดมีมม. 1 IPTG ที่ 37 C สำหรับ 4 h. เซลล์ถูกรวบรวม โดย centrifugation และ resuspendedใน 20 mL บัฟเฟอร์ A (ทริสเรทติ้ง 50 มม. – HCl, NaCl, EDTA, 0.5 mM 50 mM 2 DOC, pH 8.0),และ sonicated ที่ 4 C กับ 30 รอบ รอบแต่ละรอบประกอบด้วย 10 s s 20 และการปิดครั้ง ขั้นตอนข้างต้นถูกทำซ้ำสำหรับสอง (Marshak et al., 2000) การอัดเม็ดมี resuspended ในบัฟเฟอร์ B (20 มม.โซเดียมฟอสเฟตประกอบด้วย 8 M 40 mLurea, pH 8.0), กวนที่อุณหภูมิห้องสำหรับ 20 h และ lysate ที่ถูกต้องcentrifugation และ supernatant ไม่บริสุทธิ์ โดยพระ TrapTM FF ดิบคอลัมน์(Amersham เวลาออก Uppsala สวีเดน) โปรตีนบริสุทธิ์ถูก refolded โดย0.4 M L-อาร์จินีนในเส้น M 8-0 ยูเรียไล่ระดับ refolding บัฟเฟอร์ตามเอาแท็กของพระองค์กับ enterokinase (ซิก สหรัฐอเมริกา) สำหรับ h 16 ที่ 25 c2.1.3 การวิเคราะห์โครงสร้าง และการทำงานเทียบเท่าระบุโปรตีน Cry1Ab/Ac บริสุทธิ์ โดย SDS-หน้า เวสเทิร์น Blot ไกลโคโปรตีนวิเคราะห์และ MALDI TOF MS โปรตีนจากข้าวและเซลล์ prokaryoticถูกเรียกใช้บน 10% SDS-หน้า การโอนย้ายไปยังฟิล์มเซลลูโลส acetate (มากบริษัท กลาสโกว์ มวล., สหรัฐอเมริกา), ที่ incubated 2 h ที่อุณหภูมิห้อง 5% เอานม และ incubated 2 h ที่อุณหภูมิห้องมี polyclonal กระต่ายป้องกัน-Cry1Ab/Ac แล้วIgG ล้าง 6 ครั้ง ด้วย TBS, incubated นอกจากนี้ สำหรับ h 2 ที่อุณหภูมิห้องมีอัลคาไลน์ฟอสฟาเตสกลวงแพะกระต่ายป้องกัน IgG รองแอนติบอดี (Baomin วังของสิทธิบัตร หมายเลขสิทธิบัตร ZL200510130058.9),ล้าง ด้วย TBS 6 ครั้ง ครั้งล่าสุดที่ พัฒนา ด้วยโซลูชั่น BCIP-เอ็นบีที (Lu et al.,2007) วิเคราะห์ไกลโคโปรตีนถูกดำเนินโดยย้อมสีชุดไกลโคโปรตีน(เจาะ Rckford) หลังจาก SDS-หน้าตามคำแนะนำของผู้ผลิตวงสี CBBG โปรตีน excised และเจ่าในเจล (เซี่ย et al., 2005เฟอร์นานเด et al., 1998) แรมสเป็คตรามวลทั้งหมดของ MALDI TOF MS ได้รับในการAXIMA CFR บวก MALDI-TOF-MS (SHZMADZU Corporation ญี่ปุ่น) รับ PMFถูกเปรียบเทียบกับทฤษฎี Cry1Ab/Ac ค้นผ่านมวลเพปไทด์ฐานข้อมูล (ส่วน http://www.expasy.ch/tools/peptide-mass.html)

Results (Thai) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 การผลิตโปรตีนและลักษณะเป็นระดับการแสดงออกของ Cry1Ab / Ac โปรตีนในข้าวพันธุ์เป็นอย่างมากที่ต่ำก็เป็นที่นิยมในการดำเนินการศึกษาความปลอดภัยกับCry1Ab / Ac โปรตีนที่ผลิตในอี coli ระดับของ Cry1Ab / การแสดงออกของโปรตีน Ac คือมักจะ <3 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัม 1 ข้าววัสดุ(Cry1Ab / โปรตีน Ac ข้าวได้รับการทดสอบโดย Envirologix Cry1Ab / Cry1Ac Kit.) และจำนวนเงินที่มากมายของโปรตีนบริสุทธิ์จากข้าวสำหรับการทดสอบสัตว์จะในทางเทคนิคจะทำไม่ได้ ลักษณะที่เหมาะสมของความเท่าเทียมกันระหว่างโปรตีนและข้าวแสดงโปรตีนจำเป็นต้องเป็นก่อนจำเป็นสำหรับการใช้งานในการประเมินความปลอดภัยให้การสนับสนุนการจัดกิจกรรมยีนที่เฉพาะเจาะจง. 2.1.1 การทำให้บริสุทธิ์โปรตีนจากข้าวพันธุ์ใบCry1Ab / Ac โปรตีนบริสุทธิ์จากข้าวแช่แข็งออกจากพื้นดินในครกprechilled กับไนโตรเจนเหลว สารสกัดได้จัดทำขึ้นโดยการผสมพื้นใบมีบัฟเฟอร์สกัดในอัตราส่วน 1:10 สารสกัดถูกหมุนเหวี่ยงที่12,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีและชี้แจงต่อไปโดยการกรองผ่านตัวกรอง nitrocellulose. สกัด Cry1Ab / Ac โปรตีนบริสุทธิ์ต่อไปโดยโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดโดยใช้กระต่ายบริสุทธิ์ต่อต้านCry1Ab / แอนติบอดี Ac ป้องกัน Cry1Ab / Ac แอนติบอดีคอลัมน์ความสัมพันธ์ที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ชุด(เพียร์ซ, หมายเลขผลิตภัณฑ์ 44894) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต สารสกัดที่ได้รับอนุญาตได้อย่างอิสระไหลผ่านคอลัมน์จนอิ่มตัวแล้วโปรตีนที่ถูกชะจากคอลัมน์แอนติบอดีตามคำแนะนำของผู้ผลิต. 2.1.2 การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีน Cry1Ab / Ac จากเชื้อ E. coli PET-30a (+) - Cry1Ab / AC-RCP-BL21 (DE3) (ห้องปฏิบัติการความปลอดภัยด้านอาหาร, CAU, ปักกิ่ง, จีน) ถูกใช้ในการสูงด่วน Cry1Ab / โปรตีน Ac . Cry1Ab / AC-RCP (GenBank เลข EU816953) หมายถึงการปรับเปลี่ยนยีน Cry1Ab / ac เพื่อที่จะได้แสดงในเชื้อE. coli และทั้งของพวกเขาเข้ารหัสลำดับกรดอะมิโนที่เหมือนกัน Cry1Ab / โปรตีนฟิวชั่น Ac ได้แสดงออกดังต่อไปนี้: 6 มิลลิลิตรของโตค้างคืนวัฒนธรรมถูกบันทึกอยู่ในสื่อมิลลิลิตร200 และบ่มกับพลังสั่นที่37 องศาเซลเซียส ที่ OD600 = 0.6-1.0 ของวัฒนธรรมการแสดงออกของโปรตีนถูกชักนำด้วย1 มิลลิ IPTG ที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 ชั่วโมง เซลล์ที่ถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงและ resuspended ใน 20 มลบัฟเฟอร์ A (50 มิลลิ tris-HCl 50 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 0.5 มิลลิ EDTA, 2% DOC, pH 8.0) และ sonicated ที่ 4 องศาเซลเซียสกับ 30 รอบแต่ละรอบประกอบด้วย 10 s และ 20 s ออกครั้ง ขั้นตอนดังกล่าวข้างต้นได้รับการซ้ำสองครั้ง (Marshak et al., 2000) เม็ดที่ถูก resuspended ใน 40 มิลลิลิตรบัฟเฟอร์ B (โซเดียมฟอสเฟต 20 มิลลิมี 8 M ยูเรียมีค่า pH 8.0) กวนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 ชั่วโมงและ lysate ถูกภายใต้การหมุนเหวี่ยงและใสบริสุทธิ์โดยTrapTM FF คอลัมน์น้ำมันดิบของเขา(Amersham ชีววิทยาศาสตร์อัปซาลา, สวีเดน) โปรตีนบริสุทธิ์ถูก refolded โดย0.4 M L-arginine ในเชิงเส้น 8-0 เอ็มยูเรียลาดบัฟเฟอร์ refolding ตามด้วยการกำจัดของพระองค์Tag กับ enterokinase (ซิกม่าสหรัฐอเมริกา) เป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 25 องศาเซลเซียส. 2.1.3 สมดุลโครงสร้างและการทำงานทดสอบบริสุทธิ์ Cry1Ab / โปรตีน Ac ถูกระบุโดย SDS-PAGE, ดวงตะวัน, ไกลโคโปรตีนทดสอบและMALDI-TOF-MS โปรตีนจากข้าวและเซลล์โปรคาริโอวิ่ง 10% SDS-PAGE, โอนไปยังฟิล์มเซลลูโลสอะซิเตท (ค จำกัด , ฟอร์ด, Mass., USA) ซึ่งบ่ม 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องใน 5% ไขมันต่ำนมแล้วบ่ม 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องที่มีการป้องกัน Cry1Ab / กระต่าย Ac โพลีละล้างด้วยTBS หกครั้งนอกจากบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องกับแพะphosphatase-ผันด่างป้องกันกระต่าย IgG รองแอนติบอดี(สิทธิบัตรวัง Baomin ของสิทธิบัตร หมายเลข ZL200510130058.9) ล้างด้วย TBS หกครั้งที่ผ่านมาได้รับการพัฒนากับการแก้ปัญหา BCIP-NBT (Lu et al., 2007) ทดสอบไกลโคโปรตีนได้ดำเนินการโดยใช้ชุดไกลโคโปรตีนการย้อมสี(เพียร์ซ Rckford) หลังจาก SDS-PAGE ตามคำแนะนำของผู้ผลิต. แถบโปรตีน CBBG เปื้อนถูกตัดทิ้งและย่อยในเจล (เซี่ย et al, 2005;. เฟอร์นันเด et al, 1998. ) ทุกสเปกตรัมมวลของ MALDI-TOF-MS ที่ได้รับในAXIMA-CFR บวก MALDI-TOF-MS (SHZMADZU คอร์ปอเรชั่นประเทศญี่ปุ่น) PMF ได้รับเมื่อเทียบกับCry1Ab ทฤษฎี / Ac ค้นหาผ่านมวลเปปไทด์ฐานข้อมูล(http://www.expasy.ch/tools/peptide-mass.html)

Results (Thai) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . การผลิตโปรตีนและลักษณะ
เป็นระดับของการแสดงออกของโปรตีนในข้าวพันธุ์ cry1ab / AC เป็นอย่างมาก
ต่ำจะดีกว่าที่จะดําเนินการศึกษาความปลอดภัยกับโปรตีน cry1ab / AC ผลิต
E . coli . ระดับ cry1ab AC / การแสดงออกของโปรตีนคือโดยทั่วไป < 3 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัมข้าวของวัสดุ  1
( cry1ab / AC โปรตีนในข้าวถูกทดสอบโดย envirologix cry1ab / cry1ac
kit) และปริมาณของโปรตีนจากข้าวมากมาย สำหรับการทดสอบในสัตว์ต้อง
เป็นเรื่องยากมาก ในทางเทคนิค ลักษณะที่เหมาะสมของความสมดุลระหว่างโปรตีนรีคอมบิแนนท์โปรตีนข้าว
และแสดงความเป็นก่อนจำเป็นสำหรับ
ใช้ในการประเมินความปลอดภัยเพื่อสนับสนุนกิจกรรมอุตสาหกรรมที่เฉพาะเจาะจง
2.1.1 . บริสุทธิ์โปรตีนจากข้าวพันธุ์ใบ
การ cry1ab / AC โปรตีนบริสุทธิ์จากใบข้าวบดแช่แข็งในครก
prechilled ด้วยไนโตรเจนเหลว . สารสกัดที่เตรียมโดยการผสมดินใบ
การสกัดด้วยบัฟเฟอร์ ในอัตราส่วน 1 : 10 . สารสกัดที่เป็นระดับที่
12 , 000 รอบต่อนาที 10 นาทีต่อการชี้แจงโดยการกรองผ่านเครื่องกรอง
ไนโตร .โปรตีนสกัด cry1ab / AC ได้บริสุทธิ์ โดยโครมาโตกราฟีโดยใช้กระต่าย anti-cry1ab
6 ? / AC แอนติบอดี anti-cry1ab / AC )
6 คอลัมน์ถูกสร้างโดยใช้ชุด ( Pierce , จำนวนสินค้า 44894
) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต สารสกัดที่ได้รับอนุญาตได้อย่างอิสระไหลผ่านคอลัมน์จนอิ่มตัวแล้ว
โปรตีนมีตัวอย่างจากคอลัมน์
แอนติบอดีตามคำแนะนำของผู้ผลิต 2.1.2
. การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของ cry1ab / AC โปรตีนจากเชื้อ E . coli
pet-30a ( ) - cry1ab / ac-rcp-bl21 ( DE3 ) ( ปฏิบัติการความปลอดภัยอาหาร Cau , ปักกิ่ง ,
จีน ) ใช้ขอแสดง cry1ab AC / โปรตีน cry1ab / AC rcp ( ขนาด
เข้าไม่ eu816953 ) หมายถึงการแก้ไข cry1ab / AC ยีนเพื่อแสดง
ในโคไลและทั้งสองของพวกเขาเข้ารหัสเดียวกันลำดับกรดอะมิโน
cry1ab / AC โปรตีนได้ดังนี้ 6 ml จากค้างคืนโต
วัฒนเพิ่มขนาด 200 มิลลิลิตร และบ่มด้วยแรงสั่นที่
37  C ที่ od600 = 0.6 และ 1.0 ของวัฒนธรรม การแสดงออกของโปรตีนถูกชักนำด้วย
1 มม. เข้าที่ 37  องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 ชั่วโมง เซลล์มีจำนวน 3 resuspended
และใน 20 ml บัฟเฟอร์ ( 50 มม. โดย– HCL 50 mM NaCl 0.5 mM EDTA , 2% DOC , pH 8.0 )
sonicated ที่ 4 และ  C 30 รอบ แต่ละรอบประกอบด้วย 10 และ 20 S ออก
ครั้ง ขั้นตอนข้างต้นกันสองครั้ง ( มาร์เชิก et al . , 2000 ) เม็ด
ถูก resuspended ใน 40 ml buffer b ( 20 มิลลิเมตรโซเดียมฟอสเฟตที่มี 8 M
ยูเรีย , pH 8.0 ) กวนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 ชั่วโมง และ lysate ถูกกระทำ
การปั่นและนำบริสุทธิ์ โดยเขา traptm FF ดิบคอลัมน์
( ชาม ชีววิทยาศาสตร์ อุปซอลา , สวีเดน ) โปรตีนบริสุทธิ์ refolded โดย
0.4 M แอลอาร์จีนีนในเส้น 8 – 0 M ยูเรียลาด refolding บัฟเฟอร์ตามด้วยการกำจัด
ของของเขา  แท็กกับพนักงานบัญชี ( Sigma , USA ) 16 H 25  C .
ทาง . โครงสร้างและการทำงานเทียบเท่า assay
และ cry1ab / AC โปรตีนถูกระบุโดยเฉพาะ - หน้า Western blot assay ,
maldi-tof-ms. โปรตีนและโปรตีนจากข้าวและเซลล์โพรคาริโอติก
ถูกวิ่งบน 10% SDS - หน้า ย้ายบนเซลลูโลสอะซิเตทฟิล์ม ( มิลลิ
Co . , ฟอร์ด , มวล . , USA ) ซึ่งบ่ม 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง 5 %
นมไขมันต่ำ ,และบ่มที่อุณหภูมิห้อง 2 H / AC ใช้กับ anti-cry1ab กระต่าย
IgG , ล้างกับ TBS หกครั้ง นอกจากนี้ บ่มที่อุณหภูมิห้อง
2 H ด้วยอัลคาไลน์ ฟอสฟาเตสและแพะกระต่ายระดับแอนติบอดี IgG anti
( วัง baomin สิทธิบัตร , สิทธิบัตรหมายเลข zl200510130058.9 )
ล้างกับ TBS หกครั้ง ล่าสุดพัฒนา bcip –โซลูชั่น NBT ( Lu et al . ,
2007 )ไกลโคโปรตีน ( โดยใช้โปรตีนจากชุด
( เพียร์ซ rckford ) หลังจาก SDS –หน้าตามคำแนะนำของผู้ผลิต
cbbg เปื้อนแถบโปรตีนตัดและย่อยในเจล ( Xia et al . , 2005 ;
Fernandez et al . , 1998 ) สเปกตรัมมวลทั้งหมดของ maldi-tof-ms ได้รับบน
axima-cfr บวก maldi-tof-ms ( shzmadzu Corporation , Japan ) ระบบได้รับ
เปรียบเทียบกับทฤษฎี cry1ab / AC ค้นหาผ่านฐานข้อมูลเพปไทด์มวล
( http : / / www.expasy . CH / เครื่องมือ / เปปไทด์ มวล . html )